(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210603747.0 (22)申请日 2022.05.30 (71)申请人 上海仕欧炆基因科技有限公司 地址 201401 上海市奉贤区沪杭公路2 28弄 3号楼10层10 07、 1011室 (72)发明人 韩明明　王正远　 (74)专利代理 机构 上海天翔 知识产权代理有限 公司 312 24 专利代理师 吕楚姗 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种检测多种呼吸道病原体的引物及探针 组合及试剂盒及应用 (57)摘要 本发明公开了一种检测多种呼吸道病原体 的引物及探针组合， 其特征在于， 所述引物为RPA 多重引物和巢式RPA引物， 所述探针为巢式RPA 探 针； 所述RPA多重引物具体为SEQ  NO.1‑24所示的 上游或下游RPA多重引物所组成的引物对； 所述 巢式RPA引物具体为SEQ  NO.25‑48所示的上游或 下游巢式RPA引物所组成的引物对； 所述巢式RPA 探针为如SEQ  NO.49‑60所示的序列。 本发明还公 开了对应的试剂盒及应用。 通过几种技术的优势 结合， 以及独特设计的引物探针， 一次反应可检 测12种呼吸道病原体， 1.5小时内完成PCR扩增， 信号读取， 结果报告； 检测灵敏度为100拷贝/反 应。 权利要求书1页 说明书11页 序列表10页 附图6页 CN 115261512 A 2022.11.01 CN 115261512 A 1.一种检测多种呼吸道病原体的引物及探针组合， 其特 征在于， 所述引物为RPA多重引物和巢式RPA引物， 所述探针为 巢式RPA探针； 所述RPA多重引物具体为SEQ  NO.1‑24所示的上游或下游RPA多重引物所组成的引物 对； 所述巢式RPA引物具体为SEQ  NO.25‑48所示的上游或下游巢式RPA引物所组成的引物 对； 所述巢式RPA探针为如SEQ  NO.49‑60所示的序列。 2.如权利要求1所述的一种检测多种呼吸道病原体的引物及探针组合， 其特征在于， 所 述RPA多重引物中的上游或下游RPA多重引物的摩尔比例为1:1。 3.一种检测多种呼吸道病原体的试剂 盒， 所述试剂 盒包括如权利要求1或2所述引物及 探针组合， 其特征在于， 所述多种呼吸道病原体为冠状病毒OC43型、 人偏肺病毒、 鼻病毒、 甲 型流感病毒A型、 甲型H1N1流感病毒、 乙型流感病毒、 冠状病毒HKU1型、 冠状病毒NL63型、 冠 状病毒229E型、 副流感病毒2型、 副流感病毒3型、 呼吸道合胞病毒。 4.一种检测多种呼吸道病原体的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括重组酶聚合 酶冻干酶粉、 水解缓冲液、 醋酸镁溶 液及去离 子水。 5.如权利要求3或4所述的一种检测多种呼吸道病原体的试剂盒的应用， 其特征在于， 所述应用为通过等温扩增、 多重PCR扩增和巢式PCR扩增对样本核酸进行处理， 进行所述多 种呼吸道病原体的检测。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115261512 A 2一种检测多种呼吸道病原体的引物及 探针组合及 试剂盒及 应用 技术领域 [0001]本发明涉及基 因检测领域， 具体涉及一种检测多种呼吸道病原体的引物及探针 组 合及试剂盒及应用。 背景技术 [0002]聚合酶链式反应(PCR)技术自1983年由Mullis等发明以来， 在生命科学研究等方 面得到广泛应用。 传统的P CR反应中， 在存在DNA模板、 引物、 四种dTTP、 适当的缓冲液的反应 混合物的条件下， 通过DNA聚合酶催化从而对目的DNA片段进行扩增。 PCR反应一般包括变 性、 退火和延伸三个步骤， 每个步骤重复30至40次， 由此对少量目的DNA片段进行指数级扩 增已达到可以检测的水平。 由于PCR技术可将少量核酸分子进行扩增达到仪器可检测的水 平， 因此迅速应用于多个领域， 例如， 疾病诊断、 动植物病理学研究、 微 生物检测等 等。 [0003]基于PCR的强大的扩增能力， 在实际应用中， 将PCR与其它 分子生物学方法以及免 疫学方法等相结合发展得到了多种检测技术， 例如荧光定量PCR技术、 多重PCR检测技术等 已在疾病检测方面得到广泛使用。 [0004]目前对传感染病原体进行检测的金标准是基于聚合酶链式反应PCR的实时荧光定 量方法， 需要在循环之间进行温度的转换， 而且由于扩增效率较低， 导致耗时长， 很难检测 到低拷贝 数的病毒核酸， 导致ct 值偏大， 易于在病原 微生物医学检测出现假阴性结果， 灵敏 度低。 同时该方法缺点是一次只能检测1种病原微生物， 结合多重PCR技术与多色荧光标记 技术其检测通量得到一定提高。 但受到荧光种类与荧光相互干扰的限制， 目前基于多重Q   PCR大多产品集中在3 ‑5种靶标的检测， 一次反应检测的病原体数 目较少， 难以满足临床对 病原体进行多重同时检测的要求。 [0005]目前已经研发出多种等温体外核酸扩增技术， 如TMA技术(转录介导的核酸扩增技 术)、 SDA技术(链置换核酸扩增技术)、 LAMP(环介导核酸扩增技术)、 HDA(解旋酶依赖等 温核 酸扩增技术)、 RPA 技术(重组酶介导等 温扩增)等等， 这些技术在恒定的温度(65度或者37度 左右)下就可以实现高效的核酸扩增， 从而无需使用对温度进行精准控制的PCR仪 。 [0006]其中， RPA技术被公认是可以替代PCR的核酸检测技术。 其原理是利用重组酶与引 物结合形成蛋白 ‑DNA复合物， 能在双链DNA中寻找同源序列。 一旦引物定位了同源序列， 就 会发生链交换反应形成并启动DNA合成， 对 模板上的目标区域进行指数式扩增。 [0007]另外， RPA技术有多重工具酶匹配进行有效扩增， 扩增效率远高于传统的PC R技术， 所用时间更短， 最短可在5 min内实现。 由于RPA技术具有扩增用时短、 不需昂贵仪器、 特异性 好等特点， 使其应用越来越广泛。 RPA技术的最大特点是只需要1对引物即可在40℃左右的 恒温条件下实现模板核酸的扩增， 不需要通过高低温度循环实现核酸解链和退火， 因此不 需要昂贵的仪器设备。 而且37℃的常规反应温度很容易满足， 适合基层对病原菌的快速检 测。 目前， RPA技 术已经广泛应用于人体、 动物或植物上的病毒检测。 [0008]然而同样的， 现有等温扩增技术， 一次只能进行1种至几种病原体的检测， 目前基说　明　书 1/11 页 3 CN 115261512 A 3