(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211075758.2 (22)申请日 2022.09.05 (71)申请人 江苏海洋大学 地址 222005 江苏省连云港市海州区苍梧 路59号 (72)发明人 高嵩　吉敬　廖磊　马超　王昱　 (74)专利代理 机构 南京专信知识产权代理有限 公司 326 05 专利代理师 郝晓燕 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/63(2006.01) (54)发明名称 一种检测副溶血弧菌和 霍乱弧菌的引物组、 试剂盒及方法 (57)摘要 本发明提供一种双重RPA技术检测副溶血弧 菌和霍乱弧菌的引物组和探针、 试剂盒和检测方 法。 本发明的方法可同时检测副溶血弧菌和霍乱 弧菌， 减少了测试成本， 缩短了检测时间； 该方法 无需依赖昂贵的热循环仪器， 在较低的恒温条件 下进行， 用目前市场上的便携式荧光检测仪即可 完成； 本发明中的双重Real ‑time RPA法在反应 的过程中通过实时读取两种荧光信号即可判定 结果， 无需开盖后处理， 避免了气溶胶污染和假 阳性的发生； 操作简单， 检测时间短， 特异性强、 灵敏度较高。 权利要求书2页 说明书6页 附图1页 CN 115433783 A 2022.12.06 CN 115433783 A 1.一种双重RPA技 术检测副溶 血弧菌和霍乱弧菌的引物组和探针， 分别是： 副溶血性弧菌的gyrB基因的检测引物和探针序列： VP‑F： 5'‑CGAAGAAAGCGAAAACGGCAACGTCAGGCGA‑3'； VP‑R： 5'‑CAGATAATTTCTCACCCATCGCCGATTCAACC‑3'； VP‑P： GGTTTGACAGCCGTTGTTTCAGTAAAAGTGCC[HEX ‑dT][THF][BHQ1 ‑dT] TCCAAAATTCTCGAGC C‑SpC3； 霍乱弧菌的l olB基因的检测引物和探针序列： VC‑F： 5'‑ATCTTCAAGCTGTTCAACGGGAATATCTAA‑3' VC‑R： 5'‑ATCAGCGACA ATCGTTCAACTTTCAATGGC‑3' VC‑P： ATCAGGCTTTGTGCATCTTGGTCGCGGTAGA[FAM ‑dT][THF][BHQ1 ‑dT] GATCATCATA AGTTTCG‑SpC3。 2.一种双重RPA技术检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌的试剂 盒， 其特征在于， 含有权利要 求1所述的引物组和探针。 3.根据权利要求2所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还含有RPA核酸扩增试剂， 包 括RPA反应酶冻干粉、 缓冲溶 液、 醋酸镁和d dH2O。 4.一种双重Real ‑time RPA技术检测副溶 血性弧菌和霍乱弧菌的方法， 步骤 包括： (1)提取待测样品DNA， 得到模板DNA溶 液； (2)配置预混体系： 取出一管反应酶冻干粉， 依次加入补液缓冲液、 ddH2O、 VP‑F、 VP‑R、 VP‑P、 VC‑F、 VC‑R和VC‑P， 配置预混体系后混匀； (3)RPA反应体系： 从步骤(2)配置的预混体系取出10～15 μL预混和液加入八联管中， 然 后加入模板DNA溶 液和醋酸镁； (4)实时荧光PCR检测： 将步骤(3)的八联管放入qPCR仪涡旋混匀， 继续放入qPCR仪反 应， 设置荧 光检测通道为FAM和H EX， 记录荧 光信号。 5.根据权利要 求4所述的方法， 其特征在于， 所述步骤(2)中的补液 缓冲液、 ddH2O、 VP‑F、 VP‑R、 VP‑P、 VC‑F、 VC‑R和VC‑P的加入量 为： 6.根据权利要求4所述的方法， 其特征在于， 所述步骤(3)中取出预混和液的体积为 13.25 μL， 模板DNA溶 液加入量 为1 μL， 醋酸镁的加入量 为0.75 μL， 醋酸镁的浓度为280mM 。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115433783 A 27.根据权利 要求4所述的方法， 其特征在于， 所述步骤(3)中， 涡旋混匀条件为39℃预热 4min， qPCR反应条件为39℃反应26mi n。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115433783 A 3