(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210730982.4 (22)申请日 2022.06.24 (71)申请人 江苏省人民医院 （南京医科 大学第 一附属医院） 地址 210000 江苏省南京市 鼓楼区广州路 300号 (72)发明人 时姗姗　张智弘　叶胜兵　缪琛　 (74)专利代理 机构 南京业腾知识产权代理事务 所(特殊普通 合伙) 32321 专利代理师 李静 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种检测UGT1A1基因双位点多态性的引物、 探针及试剂盒 (57)摘要 本发明公开了一种检测UGT1A1基因双位点 多态性的引物和探针， 包括检测UGT1A1*28和 UGT1A1*6基因多态性的引物和探针； 检测 UGT1A1*28基因多态性的引物序列如SEQ  ID  No.1‑2所示， 探针序列如SEQ  ID No.3‑4所示， 检 测UGT1A1*6基因多态性的引物序列如SEQ  ID  No.5‑6所示， 探针序列如SEQ  ID No.7‑8所示。 与 Sanger测序等方法比较， 采用本发明的引物和探 针来检测UGT1A1基因双位点多态性， 整个检测 DNA用量少， 并且检测速度快， 且操作简单， 对操 作人员要求低， 除石蜡样品以外， 还能够检测外 周血标本及口腔粘膜等样本， 具有应用范围广的 优势。 权利要求书1页 说明书7页 序列表2页 附图3页 CN 115029441 A 2022.09.09 CN 115029441 A 1.一种检测UGT1A1基因双位点多态性的引物和探针， 其特征在于， 所述引物和探针包 括检测UGT1A1*28基因多态性的引物和探针以及检测UGT1A1* 6基因多态性的引物和探针； 所述检测UGT1A1*28基因多态性的引物包括UGT1A1*28 ‑F和UGT1A1*28 ‑R， 其中， UGT1A1*28‑F的序列如SEQ  ID No.1所示， UGT1A 1*28‑R的序列如SEQ  ID No.2所示； 所述检 测UGT1A1*28基因多态性的探针包括U28*TA7  FAM探针和U28*TA6  VIC探针， 其中， U28* TA7FAM探针的序列如SEQ  ID No.3所示， 该序列的5 ’端连接有FAM荧光基团， 3 ’端连接有MGB 修饰基团， U28*TA6  VIC探针的序列如SEQ  ID No.4所示， 该序列的5 ’端连接有VIC荧光基 团， 3’端连接有MGB修饰 基团； 所述检测UGT1A1*6基 因多态性的引物包括UGT1A1*6 ‑F和UGT1A1*6 ‑R， 其中， UGT1A1*6 ‑ F的序列如SEQ  ID No.5所示， UGT1A1*6 ‑R的序列如SEQ  ID No.6所示； 所述检测UGT1A1*6基 因多态性的探针包括U6*G  FAM探针和U6*A  VIC探针， 其中， U6*G  FAM探针的序列如SEQ  ID  No.7所示， 该序列的5 ’端连接有FAM荧光基团， 3 ’端连接有MGB修饰基团， U6*A  VIC探针的序 列如SEQ ID No.8所示， 该序列的5 ’端连接有VIC荧 光基团， 3 ’端连接有MGB修饰 基团。 2.一种检测UGT1A1基因双位点多态性的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括权利要 求1所述检测 UGT1A1*28基因多态性的引物和探针以及检测 UGT1A1*6基因多态性的引物和 探针。 3.如权利 要求2所述检测UGT1A 1基因双位点多态性的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒 还包括阴性对照品和阳性对照品。 4.如权利 要求3所述检测UGT1A 1基因双位点多态性的试剂盒， 其特征在于， 所述阴性对 照品为超纯水， 所述阳性对照品包括UGT1A1*28( ‑53TA6＞TA7)位点的纯合野生型对照品、 杂合突变型对照品、 纯合突变型对照品以及 UGT1A1*6(211G＞A)位点的纯合野生型对照品、 杂合突变型对照品、 纯合突变型对照品， 阳性对照品是采用经过Sanger测序法验证过的临 床石蜡样本的基因 组DNA制成的。 5.一种检测UGT1A1基因双位 点多态性的方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： (1)提取检测样本中的基因 组DNA； (2)以获得的基因组DNA为模板， 采用权利要求2或3或4所述试剂盒中的引物和探针进 行实时荧 光定量PCR反应， 然后进行荧 光检测； (3)根据检测结果判断样本DNA中UGT1A1*28和UGT1A1* 6等位基因的类型。 6.如权利 要求5所述的检测UGT1A 1基因双位点多态性的方法， 其特征在于， 步骤(2)中， 所述PCR反应的反应条件为： 60℃1min， 95℃ 预变性1min； 95℃5s， 60℃34s， 共45个循环； 60 ℃1min， 在60℃时收集FAM和VIC荧 光信号进行检测。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115029441 A 2一种检测UGT1A1基因双位点多态性的引物、 探针及 试剂盒 技术领域 [0001]本发明属于生物技术领域， 具体涉及一种检测UGT1A1基因双位点多态性 的引物、 探针及试剂盒。 背景技术 [0002]伊立替康(Irinotecan， CPT ‑11)是治疗转移性结直肠癌或晚期大肠癌最有效的化 疗药物之一。 伊立替康可以与拓扑异构酶 Ⅰ及DNA形成的复合物， 引起DNA单链断裂， 阻止DNA 复制及抑制RNA合成， 阻止或减缓肿瘤细胞生长。 然而， 伊立替康引起的嗜中性粒细胞的减 少和严重肠毒性问题， 成为限制其用药剂量的关键因素之一。 研究表明， 尿苷 二磷酸葡萄糖 醛酸转移酶(uridine  diphosphate  glucuronosyl  transferase  1A1,UGT1A1)的多态性与 化疗药物伊立替康不良反应具有密切相关性， 最常见的UGT1A1*6及UGT1A1*28基因突变型 的蛋白表达量只有野生纯合型 的70％， 显著减少该酶的活性， 从而增加伊立替康化疗患者 发生不良反应的风险。 因此， 通过检测UGT1A1*28和UGT1A1*6双位点的多态性， 可以从基因 水平上预测伊立替康对肿瘤患者的毒副作用的发生， 为临床制定伊立替康的给药剂量提供 参考。 [0003]目前基因突变临床 最重要的检测方法是Sanger测序， Sanger测序法通常检测的是 外周血样本或口腔粘膜样本， 存在操作复杂、 灵敏度较低、 检测时间较长、 假阴性率较高等 问题。 石蜡样本是最常见的肿瘤基因检测样本， 因为使用经过福尔马林固定、 石蜡包埋是常 温长期保存组织蛋白和核酸分子的经典方法， 几乎所有医疗机构均会采用石蜡包埋方法保 存肿瘤组织。 但是石蜡样本提取的DNA质量受到多种因素的干扰和影响。 研究发现福尔马林 在细胞内大分子与DNA之间产生交联， 造成PCR扩增的酶效率降低； 福尔马林固定引起的DNA 片段化损伤， 导致PCR扩增的可扩增模板量降低。 此外由于FFPE样 本暴露于环 境条件下的长 期储存会诱导DNA碎片化， 这些因素都会导致针对石蜡样本进行分子检测的局限性。 因此， 采用Sanger测序法检测石蜡样本， 更会影响检测的准确性， 限制了临床医生对药物疗效的 判断。 [0004]因此， 需要找一种灵敏性高、 特异性强、 简便易行、 结果判定简单的石蜡样本突变 检测的方法， 有助于对肿瘤患者实施个 体化的精准医疗。 发明内容 [0005]本发明目的是解决现有技术中检测UGT1A1基因双位点多态性的方法存在的灵敏 度低、 操作复杂、 检测时间长等问题， 提供一种用于检测UGT1A1基因双位点多态 性的引物和 探针， 其可以用于检测石蜡样本， 整个检测过程只需60分钟 完成， 操作简便， 结果判定简单 且重复性好， 经过双 盲实验， 与Sanger测序及片段化结果比较 分析， 精确度及准确度均达到 100％； 可以更好的适用于及时诊 治的迫切临床需求， 助力肿瘤患者精准检测。 [0006]技术方案 [0007]一种检测UGT1A1基因双位点多态性的引物和探针， 所述引物和探针包括检测说　明　书 1/7 页 3 CN 115029441 A 3