(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210648714.8 (22)申请日 2022.06.09 (71)申请人 广州血康陆道培生物技 术有限公司 地址 510700 广东省广州市黄埔区崖鹰石 路10号B415 (72)发明人 胡斌　王军　刘刚　 (74)专利代理 机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 专利代理师 赵崇杨 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种检测BCR-ABL1融合基因亚型P190型的 引物组及试剂盒 (57)摘要 本发明公开了一种检测BCR ‑ABL1融合基因 亚型P190型的引物组及试剂盒。 所述引物组包括 一对引物和一条探针， 探针采用锁核酸标记后进 行PCR扩增后收集荧光信号， 可明显提高检测的 灵敏度和特异性； 本发明的检测引物组可以实现 每106个有核细胞中检出一个含BCR ‑ABL1融合基 因亚型P190型的白血病细胞， 且1小时内即可得 到检测结果， 从而满足白血病早期诊断、 早期治 疗的要求。 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图2页 CN 115044675 A 2022.09.13 CN 115044675 A 1.一种检测BCR ‑ABL1融合基因亚型P190型的引 物组， 其特征在于， 包括一对引物和一 条探针； 所述引物的上游引物序列为5 ’ ‑ttgtcgtgtcc gaggccacca ‑3’， 下游引物序列为5 ’ ‑ gaccctgaggctcaaagtcaga ‑3’； 所述探针序列为5 ’ ‑aaGacCggGcAgatcTg ‑3’， 5端’标记荧光 基团， 3’标记淬灭基团。 2.根据权利要求1所述引物组， 其特征在于， 所述荧光基团选自FAM、 VIC、 HEX、 Cy5中的 任意一种。 3.根据权利要求1所述引物组， 其特征在于， 所述淬灭基团选自TAMRA、 Cy3、 BHQ ‑1中的 任意一种。 4.权利要求1～3任一所述引物组在非疾病诊断目的检测BCR ‑ABL1融合基因亚型P190 型或在制备检测BCR ‑ABL1融合基因亚型P190型的产品中的应用。 5.一种检测BCR ‑ABL1融合基因亚型P190型的产品， 其特征在于， 包含权利要求1～3任 一所述引物组。 6.根据权利要求5所述产品， 其特征在于， 还包含PCR反应液、 PCR反应酶系、 BCR ‑ABL1融 合基因亚型P190型 阳性质控品以及阴性质控品。 7.权利要求5或6所述产品在非疾病诊断目的检测BCR ‑ABL1融合基因亚型P190型中的 应用。 8.一种非疾病诊断目的检测BCR ‑ABL1融合基因亚型P190型的方法， 其特征在于， 包括 如下步骤： S1.提取样品RNA； S2.将步骤S1所述样品RNA反转录成cDNA模板或直接以步骤S1所述样品RNA为模板， 利 用权利要求1～3任一所述引物组进行一 步法荧光定量PCR扩增反应； S3.结果判定： 通过扩增曲线进行判定， 若扩增曲线呈明显单一S型曲线， 则判定样品中 有BCR‑ABL1融合基因亚型P190型。 9.根据权利要求8所述方法， 其特征在于， 所述一步法荧光定量PCR扩增体系为20μM引 物0.8μL， 20μM探针0.4μL， 5 ×一步法RT ‑PCR缓冲液5μL， 热启动酶2U， MMLV酶100U， dNTPs   25mM 0.6 μL。 10.根据权利要求8所述方法， 其特征在于， 所述一步法荧光定量PCR扩增程序为50℃ 15min； 95℃10mi n； 95℃15sec， 58℃45sec， 45个 循环。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115044675 A 2一种检测BCR ‑ABL1融合基因亚型P190型的引物组及 试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及医学检测技术领域， 更具体地， 涉及一种检测慢性髓性白血病和急性 髓性白血病BCR ‑ABL1融合基因亚型P190型的引物组及试剂盒。 背景技术 [0002]慢性髓性白血病(Chronic  myelogenous  leukemia， CML)是骨髓造血干细胞克隆 性增殖形成的恶性肿瘤， 绝大多数患者缓慢起病， 早期常无症状， 临床逐步出现乏力、 食欲 不振、 腹部胀满、 盗汗和体重降低， 偶因体检发现白细胞计数增高或左上腹包块而作进一步 检查。 Ph染色体或bcr/abl融合基因为诊断必备条件。 急性髓细胞性白血病(acute   myelogenous  leukemia， AML)是髓系造血干/祖细胞恶性疾病。 以骨髓与外周血中原始和幼 稚髓性细胞异常增生为主要 特征， 临床表现为贫血、 出血、 感染和发热、 脏器浸润、 代谢异常 等， 多数病例病情急重， 预后凶险， 如不及时治疗常可危及生命。 本病占小儿白血病的30％。 目前主要根据细胞 形态学、 免疫分型和遗传特 征对急慢性髓性白血病进行综合诊断。 [0003]随着分子生物学技术的发展及对白血病分子遗传学的深入研究， 已知白血病中存 在着染色体结构畸变， 包括缺失、 重复、 倒位、 易位等， 涉及至少数十种融合基因， 融合基因 形成是白血病的发生和发展的重要机制， 对相关融合基因检测， 可以达到精准诊断的目的， 同时融合基因的定性和定量分析还可以作为预后评估的有效手段， 在形态学完全缓解的基 础上， 使诊断更加准确。 [0004]BCR‑ABL1融合基因是t(9； 22)(q34； q11)易位(P h染色体)导致， 是由位于22q11.21 的BCR基因和位于9q34.1的ABL1基因分别断裂并融合形成。 根据BCR基因的断裂位点不同， 可分为m‑BCR(P190)、 M ‑BCR(P210)和u ‑BCR(P230)三种， 正确诊断这三种亚型对后续临床治 疗判定预后具有重要的指导作用。 在90％～95％的慢性髓性白血病患者中可检测到BCR ‑ ABL1(P190和P210型)融合基因， 该融合基因同时也是急性髓性白血病的检测指标之一。 [0005]目前检测融合基因mRNA表达的方法有高通量转录组测序分析、 Northern  blot、 荧 光原位杂交(FISH)和实时荧光定量PCR(qPCR)。 A.高通量转录组测序 分析可对细胞mRNA及 非编码RNA进行整体测序分析， 能够一次性分析已知的 白血病相关融合基因及基因表达谱， 但这样技术仅能用于科研， 费用高昂、 耗时极长， 仅后续生物信息学分析就需一周时间， 而 且不能针对一个位点， 是一种 “大撒网”式技术， 不能应用于临床快速检测。 B.Northern   blot采用琼脂糖凝胶电泳， 在变性条件下将待检的RNA样品通过印迹转移至固相支持物如 纤维素膜 等上面， 在用标记过的cDNA探针， 根据碱基互补原则进 行杂交后显影， 显示 强度可 表明RNA在所测样 本中的相对含量。 缺点是灵敏度低、 信号弱， 纤维素膜显示后有高背 景， 影 响判断。 C.FIS H是一种非放射性原位杂交技术， 将 cDNA片段标记上生物素等报告分子， 通过 杂交后报告分子与亲和素之间的免疫化学反应， 在荧光显微镜下对待测RNA进行定性或定 位分析。 它的优点是定位准确、 荧光信号 强。 缺点是杂交不能达到100％的效率， 特别是在应 用较短的cDNA探针时效率会明显下降， 容易造成漏检， 同时因为是通过荧光显微镜观 察， 主 观性强， 对操作人员的技术要求高， 很难在医院大规模应用。 实时荧光定量PCR(qPCR)具有说　明　书 1/6 页 3 CN 115044675 A 3