(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210596116.0 (22)申请日 2022.05.27 (71)申请人 广西大学 地址 530004 广西壮 族自治区南宁市西乡 塘区大学路100号 申请人 广西科学院　 广西产研院绿 色低碳技术研究所有 限公司 (72)发明人 王佳乐　姚作芳　王英辉　赖俊翔　 张威　李垚　 (74)专利代理 机构 南宁智卓专利代理事务所 (普通合伙) 4512 9 专利代理师 谭月萍 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01)C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/89(2006.01) (54)发明名称 一种校正海洋微生物样本核酸提取损失的 方法 (57)摘要 本发明公开了一种校正海洋微生物样本核 酸提取损失的方法， 包括以下步骤： (1)利用淡 水 藻类的基因组DNA作为标准品； (2)在淡 水藻类的 rDNA上设计一对特异性引物和一条探针； (3)计 算所设计的引物与探针的扩增效率； (4)计算该 标准品与海洋 微生物共提取过程中的基因组DNA 提取效率， 从而通过基因组DNA提取效率， 校正海 洋微生物样 本在核酸提取过程中的基因组DNA的 损失。 本发 明通过利用所设计的淡水藻类特异性 rDNA引物和探针， 建立校正体系， 可 实现方便、 快 捷及准确地计算海洋微生物样本在核酸制备过 程中的损失； 对海洋有害微生物的准确评估、 精 准预报以及合理的管理决策制定具有重大的推 动作用， 具有很好的应用前 景。 权利要求书1页 说明书6页 附图2页 CN 114854897 A 2022.08.05 CN 114854897 A 1.一种校正海洋微 生物样本核酸 提取损失的方法， 其特 征在于： 包括以下步骤： (1)利用淡水藻类的基因 组DNA作为标准品； (2)在淡水藻类的rDNA上设计一对特异性引物和一条探针； (3)计算所设计的引物与探针的扩增效率； (4)计算该标准品与海洋微生物共提取过程中的基因组DNA提取效率， 从而通过基因组 DNA提取效率， 校正该微 生物样本在核酸 提取过程中的基因 组DNA的损失； 核酸损失率 ＝1–提取效率 其中， E为所设计的引物与探针的扩增效率； Ct1为淡水藻类基因组DNA在海洋微生物样 本提取前的扩增Ct值； Ct2为淡水藻类基因组DNA在与微生物样本共提取后的扩增Ct值； V1为 微生物样本提取前所加入的淡水藻类基 因组DNA溶液的体积； V2为淡水藻类基 因组DNA在与 微生物样本共提取后的溶 液体积。 2.根据权利要求1所述的校正海洋微生物样本核酸提取损失的方法， 其特征在于： 所述 淡水藻类为 雨生红球藻。 3.根据权利要求1所述的校正海洋微生物样本核酸提取损失的方法， 其特征在于： 所述 特异性引物为HP f1及HPr1， 其核苷酸序列分别为5' ‑ATGGACAACTCTCAACAACGGATA ‑3'； 5'‑ TTCGAAGCCGATTCTCGTACAG ‑3'。 4.根据权利要求1所述的校正海洋微生物样本核酸提取损失的方法， 其特征在于： 所述 探针为HPp1， 其核苷酸序列为5' ‑VIC‑CAGCGAAATGCGAAAC‑MGB‑3'。 5.根据权利要求1所述的校正海洋微生物样本核酸提取损失的方法， 其特征在于： 在步 骤(3)， 通过对已知质量的2倍系列稀释的淡水藻类基因组DNA进行qPCR扩增， 构建Ct值与 DNA质量之间的稀释曲线， 即可计算出 所设计的引物与探针的扩增效率。 6.根据权利要求1至5任一项所述的校正海洋微生物样本核酸提取损失的方法， 其特征 在于： 在步骤(4)， 在海洋微生物核酸提取前， 首先加入一定体积的淡水藻类基因组DNA， 然 后与海洋微生物样本一起制备基因组DNA； 然后， 分别使用目标海洋微生物、 淡水藻类的引 物和探针对提取后的核酸样本进行qPCR扩增。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114854897 A 2一种校正海洋微生物样本 核酸提取损 失的方法 技术领域 [0001]本发明涉及分子生物学方法定量分析环境微生物的分析技术领域， 尤其涉及 一种 校正海洋微 生物样本核酸 提取损失的方法。 背景技术 [0002]对海洋环境中的微生物(有害 藻华、 病原微生物)的准确的定量监测和评估一直以 来都是监管部门和研究者们的非常关注的重要课题。 实时定量聚合 酶链式反应(qP CR)方法 彻底改变了对环境微生物的监测， qPCR方法目前已经逐渐取代传统的显微镜和流式细胞 术， 应用于环境有害微生物的定量监测与评估。 该方法由于其高灵敏度和特异 性， 能对传统 方法难以鉴定许多环境 微生物进行准确识别与定量分析。 [0003]qPCR方法能与 海洋环境微生物样本的核酸靶点产生特异性的可定量数据。 这些数 据对于微生物群落的相互作用和过程的描述、 海洋环境中的有害微生物的污染程度(水、 空 气)的评估、 有害藻华的监测与预警、 干预措施的制定(藻华消杀、 海 滩娱乐场所病原 微生物 的消毒与传染病传播的遏制)至关重要。 然而， 要实现以上目的， 需要这些为监管部门和 研 究者所提供的qPCR监测数据是准确无误的。 [0004]由于基于qPCR定量的环境微生物样本在其核酸制 备过程中会存在基因拷贝数的 损失， 比如液体转移时的残留、 操作不慎导致液体的损失等等， 都会造成核酸制备时微生物 样本基因拷贝数 的损失， 从而导致对环境微生物的定量监测与评估不够准确， 使得监管部 门和研究者无法做出准确的判断以及有效的风险控制方案。 因此， 开发一种能够校正海洋 环境微生物样本核酸损失的方法很有必要。 [0005]现有文献报道可以使用重组质粒标准品去校正样本在核酸提取过程中基因的损 失。 该方法如果对海水样本没有产生特异性的扩增信号， 经过验证后在一定程度上是可以 实现对海洋环境微生物样本核酸提取损失的评估， 但使用重组质粒的方法可能在实际操作 过程中比较繁琐， 因为需要使用载体构建重组质粒标准品， 此外在基因损失的计算过程中 需要用到所构建的重组质粒 标准曲线。 发明内容 [0006]本发明的目的在于针对现有技术中存在的不足， 提供一种便捷、 有效的海洋微生 物样本核酸提取损失的计算与校正方法， 为海洋环境有害微生物的准确定量评估、 精准的 预报提供有效的技 术支持。 [0007]为了实现上述目的， 本发明采用的技 术方案如下： [0008]一种校正海洋微 生物样本核酸 提取损失的方法， 包括以下步骤： [0009](1)利用淡水藻类的基因 组DNA作为标准品； [0010](2)在淡水藻类的rDNA上设计一对特异性引物和一条探针； [0011](3)计算所设计的引物与探针的扩增效率； [0012](4)计算该标准品与 海洋微生物共提取过程中的基因组D NA提取效率， 从而通过基说　明　书 1/6 页 3 CN 114854897 A 3