(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210770743.1 (22)申请日 2022.06.30 (71)申请人 湖南家辉生物技 术有限公司 地址 410205 湖南省长 沙市高新 开发区麓 谷麓景路2号 (72)发明人 曾桥　罗娇娇　刘亚宁　 (74)专利代理 机构 北京高沃 律师事务所 1 1569 专利代理师 苏士莹 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种新的ATP7B突变 基因及其诊断试剂 (57)摘要 本发明提供了一种新的ATP7B突变基因及其 诊断试剂， 属于医学诊断技术领域。 本发明通过 外显子组测序技术首次发现了ATP7B:NM_ 000053.4:exon13:c.2929A>C:p.T977P和 exon18:c.3724G>A:p.E1242K位点发生复合杂合 突变可以导致肝豆状核变性。 本发 明的研究成果 可以用于肝豆状核变性的遗传学诊断， 为肝豆状 核变性的发病机制研究提供了新的基础和途径， 为肝豆状核变性的治疗提供新的理论依据， 可以 为治疗肝豆状核变性 提供可能的药物靶点。 权利要求书1页 说明书20页 序列表11页 附图4页 CN 115141884 A 2022.10.04 CN 115141884 A 1.一种引发肝豆状核变性的突变基因， 其特征在于， 所述突变基因包括在ATP7B:NM_ 000053.4:exon13:c.2929A>C:p.T977P和exon18:c.3724G>A:p.E1242K位点发生复合杂合 突变。 2.一种由权利要求1所述突变基因引发的肝豆状核变性的检测试剂， 其特征在于， 所述 检测试剂包括针对所述基因突变的位 点设计的特异性扩增引物。 3.根据权利要求1所述检测试剂， 其特征在于， 所述特异性扩增引物包括ATP7B ‑1F、 ATP7B‑1R、 ATP7B ‑2F和ATP7B ‑2R， 所述ATP7B ‑1F的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示， 所述 ATP7B‑1R的核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示， 所述ATP7B ‑2F的核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所 示， 所述ATP7B ‑2R的核苷酸序列如SEQ  ID NO.4所示。 4.一种肝豆状核变性的检测试剂盒， 其特 征在于， 包括权利要求2或3所述检测试剂。 5.根据权利 要求4所述检测试剂盒， 其特征在于， 还包括PCR扩增反应的试剂， 和/或DNA 测序时所需的试剂和 测序引物。 6.根据权利要求5所述检测试剂盒， 其特征在于， 所述测序引物包括ATP7B ‑Seq1F、 ATP7B‑Seq1R、 ATP7B ‑Seq2F和ATP7B ‑Seq2R， 所述ATP7B ‑Seq1F的核苷酸序列如SEQ  ID NO.5 所示， 所述ATP7B ‑Seq1R的核苷酸序列如SEQ  ID NO.6所示， 所述ATP7B ‑Seq2F的核苷酸序列 如SEQ ID NO.7所示， 所述ATP7B ‑Seq2R的核苷酸序列如SEQ  ID NO.8所示。 7.权利要求2或3所述检测试剂或权利要求4～6任一项所述检测试剂盒在制备肝豆状 核变性的诊断试剂中的应用。 8.根据权利要求7 所述应用， 其特 征在于， 所述诊断试剂的检测样本包括血 液或羊水。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115141884 A 2一种新的ATP7 B突变基因及其诊断试剂 技术领域 [0001]本发明属于医学诊断技 术领域， 具体涉及一种新的ATP7B突变 基因及其诊断试剂。 背景技术 [0002]肝豆状核变性又称 Wilson病(MIM  277900)， 一种常染色体隐性遗传的铜代谢障碍 性疾病， 以铜代谢障碍引起的肝硬化、 基底节损害为主的脑变性疾病为特点， 以不同程度的 肝细胞损害、 脑退行性病变和角膜边缘有铜盐沉着环为临床特征。 世界范围发病率为1/ 30000～1/100000， 致病基因携带者约为1/90。 好发于青少年， 男性比女性稍多， 如不恰当治 疗将会致残甚至死亡。 该病也是少数几种 可治的神经遗传病之一， 关键是早发现、 早诊断、 早治疗。 [0003]铜是人体所必需的微量元素之一。 许多酶促反应都需要铜离子参与， 如细胞色素 氧化酶、 过氧化物歧化酶、 酪氨酸酶、 多巴胺β ‑羟化酶、 赖氨酰氧化酶和铜蓝蛋白等。 但是， 机体内铜含量过多时， 高浓度的铜会使细胞 受损和坏死、 导致脏器功能损伤。 肝脏是进行铜 代谢的主要器官。 人体内总铜量的8 ％贮存于肝内， 其浓度居各脏器之首， 其次为脑、 心、 肾 等组织。 肝细胞依靠其溶酶体合 成铜蓝蛋白并分泌入胆汁， 人体每日经由胆汁排出铜1.2～ 1.7mg， 尿中排出量仅0.07mg左右。 当这种机制发生缺陷时， 铜自胆汁中排出锐减， 但患者肠 道吸收铜功能正常， 因此大量铜贮积在肝细胞中最终导致肝脏受损、 肝功能异常和肝硬化。 同时， 血液中非铜蓝蛋白铜含量增高， 致使由尿中排出增加和在脑、 肾、 肌肉和眼等组织中 明显大量沉积， 临床上出现各系统被累及并呈现相应症状。 通常发生于儿童和青少年期， 少 数成年期发病。 病情缓慢发展， 可有阶段性缓解或加重， 亦有 进展迅速者。 [0004]肝豆状核变性致病基因ATP7B(MIM  606882)定位于染色体13q14.3， 基因全长 79.5kb， 包含21个外显子和20个内含子， 编码1466个氨基酸组成的铜转运P型ATP酶,参与铜 的跨膜转运， ATP7B蛋白一方面转运铜至反高尔基体网络并与铜蓝蛋白前体结合、 形成功能 性的全铜蓝蛋白入血； 另一方面转运铜至胆汁以便排泄。 ATP7B蛋白主要在肝脏表达， 当 ATP7B基因突变导致ATP7B蛋白对铜的转运功能障碍时， 铜在肝脏过量沉积， 引起肝细胞线 粒体氧化应激反应并对脂质 、 蛋白质、 DNA和RNA等分子造成损伤， 导致肝细胞损伤、 肝脏脂 肪变性； 铜还可激活肝星状细胞， 加速肝纤维化进程。 当铜超过了肝脏储存容量， 就会以游 离铜的形式进入 血液， 并在脑部、 肾脏、 角膜、 关节以及肠道等部位过量沉积， 产生肝脏外的 铜毒性， 引起相应的临床表现。 [0005]人类基因数据库已公开了数百个个ATP7B基因突变位点， 其中绝大部分在肝豆状 核变性发病中具有明确致病作用。 欧洲肝豆状核变性患者人群中最常见的突变为 p.His1069Gln， 突变频率为13％～61％； 亚洲人群的常见突变为p.Arg778Leu， 突变频率为 34％～38％。 我国肝豆状核变性患者有3个高频致病突变p.Arg778Leu、 p.Pro992Leu和 p.Thr935Met， 占所有致病突变的50％～60％； 相对常见的致病突变还有p.Ala874Val、 p.Ile1148Thr、 p.Gly943A sp、 p.Gln511X、 p.Arg919Gly、 p.A sn1270Ser、 p.Arg778Gln等。 基 因突变以错义突变为主， 主要为纯合突变以及 复合杂合突变， 少 部分患者只找到单一杂合说　明　书 1/20 页 3 CN 115141884 A 3