(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211000218.8 (22)申请日 2022.08.19 (71)申请人 杭州迅灵生物科技有限公司 地址 310000 浙江省杭州市滨江区长河街 道滨安路68 8号2幢E楼三层3 05室 (72)发明人 金霞　胡彬　杨钦　黄文莺　 雷小红　董迎迎　 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/35(2006.01) (54)发明名称 一种支原体LAMP荧光检测引物组合物及其 LAMP荧光检测法 (57)摘要 本发明涉及支原 体LAMP检测技术领域， 尤其 涉及一种支原体LAMP荧光检测引物组合物及其 LAMP荧光检测法， 其中一种支原 体LAMP荧光检测 引物组合物， 由正向内引物FIP、 反向内引物BIP、 正向外引物F3、 反向外引物B3与探针LF、 LF 1、 LF‑ Q组成， 本发明大大提升LAMP检测猫杯状病毒的 特异性， 减少假阳； 可以进行多重LAMP反应； 荧光 和胶体金可以同时检测， 从而节约成本和时间； 基于荧光检测， 提升 灵敏度。 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 CN 115386646 A 2022.11.25 CN 115386646 A 1.一种支原体LAMP荧光检测引物组合物， 其特征在于， 由正向内引物FIP、 反向内引物 BIP、 正向外引物F3、 反向外引物B3与探针LF、 LF1、 LF ‑Q组成； 各引物序列具体如下： F3 5’ ‑CTCAAATGGATGGTGCTATC ‑3’； B3 5’ ‑TGGAGCATTATCTCCATCAA‑3’； FIP 5’ ‑CGAGGAACACCAACTTGTCTAGATA ‑TTAGTTGTTGCTGCAACAGA‑3’； BIP 5’ ‑bio AAGGTGAAGAAGAGATGAT TGAACT‑TCCGTATTCTGAAAGAAGTGAA‑3’； LF: 5’ ‑AAAGAATGTGTTCACGTGT TTGA‑3’； LF1: 5’ ‑（FAM） GTCAGTGCAGGCTCCCGTAAAGAATGTGTTCACGTGTTTGA （THF） GCATTGGTCCA ‑ 3’  （C3‑SPACER） ； LF‑Q： 5’ ‑ACGGGAGCCTGCACTGAC ‑3’（BHQ1） 。 2.根据权利要求1所述的一种支原体LAMP荧光检测引物 组合物， 其特征在于， 所述探针 LF1与LF‑Q替换为LF’， 其中LF’的序列为： LF’  5’ ‑（BHQ1） ATTGCGGGAGATGAGACCCGCAA （FAM ‑dT） AAAGAATGTGTTCACGTGTTTGA （THF） GCATTGGTCCA‑3’  （C3‑SPACER） 。 3.根据权利要求1或2所述的一种支原体LAMP荧光检测引物组合物， 其特征在于： 所述 反向内引物BIP设有生物 锁。 4.一种支原体LAMP荧光检测法， 其特征在于， 采用权利要求3所述的支原体LAMP荧光检 测组合物， 具体 检测方法如下： 12.5ul 2×buffer （1.6M甜菜碱， 40  mM Tris‑HCl (pH 8.8), 20 mM KCl, 20 mM  (NH4)2SO4,  4pmol LF， 16pmol  LF1和16pmol的LB ‑Q 1ul Bst 2.0 DNA polymerase， 8.4   mM MgSO4， 1.2 uM dNTPs ， 1ul Endo IV ， 加入模板2ul， 其 余加水补充至25ul； 放置在博日荧光定量PCR仪器中， 40cycles  60℃ 60s 读取FAM荧光， 反应结束后取 10ul的产物加入190ul的水中， 振荡混匀， 滴管 取约60ul液体加入核酸试纸条中， 5mi n观察。 5.根据权利要求4所述的一种 支原体LAMP荧光检测法， 其特征在于： 将所述16pmol  LF1 和16pmol的LB‑Q替换为16pmo l LF’。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115386646 A 2一种支原体LAMP荧光检测引物组合物及其LAMP荧光检测法 技术领域 [0001]本发明涉及支原体LAMP检测技术领域， 尤其涉及一种支原体LAMP 荧光检测引物组 合物及其 LAMP荧光检测法。 背景技术 [0002]自1980年PC R技术发明后， 基于PC R技术的核酸检测迅速应用到临床、 食品、 环境的 检测中， 并成为核酸检测的金标准。 但P CR的检测技术存在设备体积大、 粗样品耐受性差、 反 应时间长、 灵敏度难以达到单copy等诸多缺点， 已经难以满足现代核酸检测的要求： 速度快 （<30min） 、 超灵敏度 （1 ‑5copy/test） 、 大体积粗制样品直检 （20 ‑50%反应体积样本量） 、 野外 操作、 简单化操作等方面的指标。  在过去的20年中科学家 一直尝试通过恒温扩增的方法来 实现上述 目标， 这其中包括RCA(rolling  circle amplification)、 LAMP(loop ‑mediated   isothermal  amplification)、 RPA(recombinase  polymerase  amplification)、 NASBA (nucleic  acid sequence  based amplification)、 SDA(strand  displacement   amplification)、 HDA  (helicase  dependent  amplification)、 TMA(transcription ‑ mediated  amplification)等新型核酸恒温扩增技 术。 [0003]在这些恒温扩增技术中， 以2000年首次报道的LAMP法尤为耀眼和引人关注， 目前 占据超过60%的恒温检测市场。 核酸检测对LAMP技术如此亲赖， 究其原因， 得益于其它恒温 检测技术难以达 到LAMP技 术的综合 性优势： 1、 反应速度极快， 优化的引物组合可以达到 15min内检测到单copy分子， 检测速度 接近或超过RPA和NASBA； 能够达到超敏检测极限， 1 ‑5copy的分子能够稳定检出， 稳定性极高， 其它任何恒 温技术难以达 到如此稳定的水平； 2、 结果判读形式的多样化， 适应各种环境和条件下的核酸快速检测。 LAMP扩增作 为终点判读形式， 可不借助任何其它辅助设备， 裸眼观察检出结果。 基于钙黄绿素、 HNB、 红 黄变色、 OG橙绿变 色都可以肉 眼观察结果。 LAMP同样可借助浊度仪进行实时浊度分析。 在反 应体系中加入SYBR  Green荧光染料后， 可使用小型恒温荧光仪进行实时检测 。 以上这些结 果判读形式均可在 野外等非标准实验室进 行， 所需设备简单、 小巧、 价格低廉、 便于普及。 除 此外， 传统实验室中的荧光定量PCR仪， 同样可进行LAMP检测， 可采用SYBR  Green、 MB探针 法 或LAMP TaqMan探针法， 对于经常操作PCR检测的人员来讲， 可以无 缝对接、 无需更 换设备。 [0004]3、 对RNA病毒的漏检率低， 由于RNA病毒的突变率较高， 在PCR检测中个别突变对 PCR的扩增影响较大， 容易造成病毒漏检的假阴性。 而LAMP识别靶基因8个区段， 在这些识别 区段中个别的突变对LAMP扩增影响较小， 不 易产生漏检。 [0005]4、 试剂稳定、 易于使用。 同RPA、 NASBA等技术相比， LAMP与PCR法都采用单一酶 （或 双酶） 系统进 行反应， 生产批次稳定、 反应酶系统耐 高温， 试剂稳定性好。 在检测试剂中仅包 含酶mix一管、 引物/探针一管， 使用方便， 在荧光定量P CR机器上可方便的进 行高通量检测。 而RPA、 NASBA 等系统需要多个复合 酶， 比例严谨、 试剂稳定生产困难、 保存运输条件苛刻、 难说　明　书 1/4 页 3 CN 115386646 A 3