(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210655002.9 (22)申请日 2022.06.10 (71)申请人 南京农业大 学 地址 211225 江苏省南京市溧水区白马镇 国家农业科技园南京农业大 学基地 (72)发明人 杜星　李齐发　李琦琦　潘增祥　 杨柳　 (74)专利代理 机构 南京天华专利代理有限责任 公司 32218 专利代理师 徐冬涛　李晓峰 (51)Int.Cl. C12N 15/113(2010.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 15/85(2006.01) C12N 15/12(2006.01) (54)发明名称 一种抑制猪卵泡闭锁和颗粒细胞凋亡的 lncRNA及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种抑制猪卵泡闭锁和颗粒 细胞凋亡的lncRNA及其应用， 属于lncRNA的功能 探究技术研发领域， 公开了 所述lncRNA  NORFA的 核苷酸序列如SEQ  ID No.1所示； 所述lncRNA   NORFA在猪健康卵泡中的表达水平显著高于闭锁 卵泡； 在体外培养的猪卵巢颗粒细胞中过表达 lncRNA NORFA可显著抑制细胞凋亡水平， 而敲减 内源性lncRNA  NORFA则出现相反结果； 所述 lncRNA NORFA的靶基因为TGFBR2基因， 两者均具 有抑制猪卵泡闭锁和颗粒细胞凋亡的能力， 本发 明提供的lncRNA  NORFA为抑制卵泡闭锁、 提高母 猪繁殖力提供技术支持， 同时对养猪业的实际生 产具有重要经济价 值。 权利要求书1页 说明书6页 序列表4页 附图6页 CN 115094058 A 2022.09.23 CN 115094058 A 1.一种抑制猪卵泡闭锁和卵巢颗粒细胞凋亡的lncRNA  NORFA， 该lncRNA  NORFA的核苷 酸序列如SEQ  ID No.1所示。 2.扩增权利要求1所述抑制猪卵泡闭锁和卵巢颗粒细胞凋亡的lncRNA  NORFA的引物 对， 其特征在于， 该引物对包括核苷 酸序列如SEQ  ID No.2所示的正向引物和核苷 酸序列如 SEQ ID No.3所示的反向引物。 3.权利要求1所述的lncRNA  NORFA在抑制猪卵泡闭锁和卵巢颗粒细胞凋亡中的应用， 其特征在于， 通过在卵巢颗粒细胞中敲入或过表达所述的lncRNA  NORFA， 提高抗卵泡闭锁 与颗粒细胞凋亡的能力。 4.权利要求1所述lncRNA  NORFA的靶基因在抑制猪卵泡闭锁和卵巢颗粒细胞中的应 用， 其特征在于， 通过在卵巢颗粒细胞中敲入或过表达所述lncRNA  NORFA的靶基因， 提高抗 卵泡闭锁与颗粒细胞凋亡的能力； 所述的靶基因为TGFBR2基因， 该TGFBR2基因的序列号 为ENSSSCG00025024102。 5.根据权利 要求4所述的应用， 其特征在于， 扩增所述TGFBR2基因的引物对包括核苷酸 序列如SEQ  ID No.4所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ  ID No.5所示的反向引物。 6.权利要求1所述的lncRNA  NORFA在促进体外培养猪卵母细胞成熟能力中的应用， 其 特征在于， 过表达所述lncRNA  NORFA能够提高猪卵丘 ‑卵母细胞复合体在体外培养过程中 卵母细胞的成熟率。 7.权利要求1所述lncRNA  NORFA的靶基因在促进体外培养猪卵母细 胞成熟能力中的应 用， 其特征在于， 过表达所述lncRNA  NORFA的靶基因能够提高猪卵丘 ‑卵母细胞复合体在体 外培养过程中卵母细胞的成熟率。 8.根据权利要求3或权利要求6所述的应用， 其特征在于， 该应用通过提高猪卵巢颗粒 细胞中所述TGRBR2基因的表达水平实现。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115094058 A 2一种抑制猪卵泡闭锁和颗粒细胞凋亡的lncRNA及其应用 技术领域 [0001]本发明属于分子生物学中lnc RNA功能探究技术研发领域， 涉及一种抑制猪卵泡闭 锁与颗粒细胞凋亡的l ncRNA及其应用。 背景技术 [0002]众所周知， 卵泡的正常发育和排卵对于维持雌性哺乳动物繁殖过程至关重要， 而 卵泡闭锁作为雌性哺乳动物卵巢组织中一种普遍的生理现象， 不仅降低了原始卵泡库的利 用率， 造成生物资源的浪费， 同时严重制约了雌性哺乳动物繁殖力的发挥。 因此， 探究卵泡 闭锁的分子机制对于减少卵泡闭锁、 提高排卵率以及维持雌性动物正常的繁殖过程具有重 大意义。 目前， 研究发现颗粒细胞凋亡或程序性死亡是雌性哺乳动物卵泡闭锁的主要诱因， 而前者主要受到一个由体内、 外多因素组成的复杂网络调控。 近期， 相关研究表明长链非编 码RNAs(Long  non‑coding RNAs,lncRNAs)作为一类重要的表观遗传因子在上述过程中发 挥重要作用。 [0003]LncRNAs是一类长度大于200nt、 缺 乏开放阅读框或编码蛋白能力的内源性RNA分 子。 特征分析发现lncRNAs的表达丰度较低、 进化保守性与稳定性较差、 且具有严格的组织 表达模式， 上述特点也 成为了lncRNAs研究过程中的难点。 根据目前已发表的高通量测序研 究表明lncRNAs在卵巢组织中广泛表达， 然而仅有极少数的lncRNAs经过系统的研究并具有 完备的功能注释。 近年来， 相关研究鉴定了若干与雌性哺乳动物繁殖过程相关 的lncRNAs， 例如lncRNA  Neat1和lncRNA  H19与雌性小鼠黄体形成息息相关， 敲除上述两个lncRNAs均 可导致黄体缺失、 孕酮合成异常、 卵巢缺陷， 最终导致雌性小鼠不孕不育； 另外， linc ‑ 01572:28与lncRNA  MALAT1被证实可分别通过KIP1与ERK/MAPK轴调控人和小鼠卵巢颗粒细 胞增殖水平。 上述研究表 明lncRNAs在雌性卵巢组织中发挥重要作用， 但目前lncRNAs对雌 性哺乳动物卵巢功能和繁殖过程的影响程度尚不清楚， 尤其是对猪等大型家畜卵泡发育、 卵巢颗粒细胞状态与功能的调控及机制有 待进一步研究。 发明内容 [0004]本发明的目的在于提供一种抑制猪卵泡闭锁与卵巢颗粒细胞凋亡的lncRNA及其 应用； 本发明提供的lncRNA  NORFA的表达水平在猪卵泡闭锁过程中显著下调， lncRNA   NORFA具有抑制猪卵泡闭锁和卵巢颗粒细胞凋亡， 促进卵母细胞体外 培养成熟的功能。 [0005]本发明的目的可以通过以下技 术方案实现： [0006]本发明提供了一种抑制猪卵泡闭锁和卵巢颗粒细胞凋亡的lncRNA  NORFA核苷酸 全序列， 序列长度为739nt， 如SEQ  ID No.1所示。 [0007]本发明提供了扩增所述抑制 猪卵泡闭锁和卵巢颗粒细胞凋 亡的lncRNA  NORFA的 引物对， 包括核苷酸序列如SEQ  ID No.2所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ  ID No.3所示 的反向引物。 [0008]本发明提供了所述的lncRNA  NORFA在抑制猪卵泡闭锁和卵巢颗粒细胞凋亡中的说　明　书 1/6 页 3 CN 115094058 A 3