(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210778789.8 (22)申请日 2022.06.30 (71)申请人 龙岩学院 地址 364012 福建省龙岩市东肖镇 新罗区 东肖北路1号龙岩学院 (72)发明人 黄翠琴　包银莉　郑灿阳　高峰　 曾旭健　 (74)专利代理 机构 北京慕达星云知识产权代理 事务所 (特殊普通合伙) 11465 专利代理师 齐宝玲 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种扩增犬冠状病毒S基因全序列 的引物、 方法和应用 (57)摘要 本发明公开了一种扩增犬冠状病毒S基因全 序列的引物、 方法和应用， 引物序列如SEQ  ID  NO.1～SEQ  ID NO.2所示； 方法包 括以下步骤:步 骤一、 提取病毒RNA； 步骤二、 cDNA合成； 步骤三、 PCR扩增； 步骤四、 基因片段检测及测序。 本发明 还提供了一种犬冠状病毒S基因全序列扩增方法 的应用， 用于对犬冠状病毒S基因全序列的检测 与分析。 本公开的扩增方法， 无需采用常规多对 引物进行拼接的方案， 通过设计1对引物即实现 了犬冠状病毒S基因S基因全序列的扩增， 不仅操 作便捷， 还 可以避免在高变区域无法扩增获得目 的片段的风险。 权利要求书1页 说明书6页 序列表7页 附图2页 CN 115386655 A 2022.11.25 CN 115386655 A 1.一种扩增犬冠状病毒S基因全序列的引物， 其特 征在于， 其核苷酸序列如下: 上游引物C CoV‑S1： GTTGGATTACTAAGGAARGGTA； SEQ ID NO.1； 其中， R为A或G； 下游引物C CoV‑S2： GTACAGCGTCTACG GATG； SEQ  ID NO.2。 2.权利要求1所述的引物制备扩增 和检测犬冠状病毒S基因序列试剂盒中的应用。 3.一种扩增和检测犬冠状病毒S基因序列的试剂盒， 其特征在于， 包括SEQ  ID NO.1～ SEQ ID NO.2所示的引物， 其中， 上游引物为1 μL， 浓度为10pmol/ μL； 下游引物为1 μL， 浓度是 10pmol/ μL。 4.根据权利要求3所述的一种扩增和检测犬冠状病毒S基因序列的试剂盒， 其特征在 于， 还包括： 2×GreenTaqMix  12.5 μL、 cDNA  1 μL、 ddH2O 9.5 μL。 5.一种扩增犬冠状病毒S基因的方法， 其特征在于， 提取病毒RNA， 反转录成cDNA， 以SEQ   ID NO.1～SEQ  ID NO.2所示的引物对cDNA序列进行扩增， 最后对 扩增片段进行 纯化。 6.根据权利要求5所述的一种扩增犬冠状病毒S基因的方法， 其特 征在于， 扩增程序为： 7.根据权利要求5所述的一种扩增犬冠状病毒S基因的方法， 其特征在于， 所述纯化为 采用FastPure  Gel DNA Extraction Mini Kit试剂盒进行 纯化。 8.一种犬冠状病毒S基因全序列扩增方法的应用， 其特征在于， 用于对犬冠状病毒S基 因全序列的检测与分析。 9.如权利要求8的应用， 其特征在于， 将扩增方法获得的产物， 测序后， 进行同源性比 对， 对所扩增的犬冠状病毒 进行分类。 10.如权利要求9的应用， 其特征在于， 所述同源性比对为将测序获得的序列与NCBI上 已知的犬冠状病毒S基因进行比对。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115386655 A 2一种扩增犬冠状病毒S基因 全序列的引物、 方 法和应用 技术领域 [0001]本发明涉及犬冠状病毒S基因全序列扩增技术领域， 更具体地说是涉及一种扩增 犬冠状病毒S基因全序列的引物、 方法和应用。 背景技术 [0002]犬冠状病毒(Canine  coroanvires， CCoV)是引起犬肠道疾病 最主要的病原之一， 可引起犬的急性胃肠炎， 临床上表现为频繁呕吐、 腹泻、 沉郁、 厌食以及高发病率和低死亡 率。 该病毒既能单独致病， 也可与犬瘟热病毒、 犬细小病毒、 犬腺病毒等病原微生物发生混 合感染， 导 致严重的临床症状， 显著提高致死率， 是当前严重威胁我国养犬业的病原之一。 [0003]犬冠状病毒属于套式病毒目、 冠状病毒科、 冠状病毒属成员， 是一种带囊膜的单链 正股RNA病毒， 基因组大小为27 ‑32kb之间， 编码4个结构蛋白  (S、 E、 M、 N)和6个非结构蛋白 (ORF1ab、 ORF3a、 ORF3b、 ORF3c、 O  RF7a、 ORF7b)。 其中， S蛋白位于病毒 最外层， 是一种重要的 结构蛋白。 研究发现， S蛋白的N端与宿主细胞表面的受体结合相关， 可使病毒与细胞膜靠 近， 并参与 膜融合， 在病毒侵染细胞的过程中发挥着 至关重要的作用。 同时， S蛋白含有的抗 原表位是诱导机体产生中和抗体的主要保护性抗原。 S  蛋白的C端参与病毒粒子的装配及 蛋白的胞内运输， 并在一定程度上决定了  CCoV毒株的致病性， 是CCoV发挥 致病作用的主要 结构。 此外， 研 究发现， 编码S蛋白的S基因具有较大的可变性， 尤其是S1片段。 根据CCoV的S 基因构建系统发育树， 显示所有的CCoV毒株可分成2 个基因型， 分别为CCo  V‑I型和CCoV ‑II 型， 其中CCoV ‑II型又进一步分为3个亚型， 分别为CCoV ‑ IIa、 CCoV ‑IIb和CCoV ‑II  variant。 因此了解、 掌握CCoV的S基因的变异情况， 有助于了解CCoV的基因重组、 抗原 变异、 病毒感染细胞机制和基因变化规律， 对CCoV 致病机制的研究和疫苗等防控措施开 发均有重 要的指导 意义。 [0004]CCoV的S基因长度为4362bp左右， 且变异程度大， 因此， 当前CCoV  S 基因变异情况 的研究主要通过选择S基因中部分序列片段进 行， 长度一般为20  0‑500bp左右， 无法准确反 应整个S基因的变异情况； 或通过将 CCoV的S基因分成多个相互重叠的基因片段进 行引物设 计和扩增， 拼接后获得S基因全长序列， 不仅工作量大， 而且还存在高变区域无法扩增获得 目的片段的风险。 [0005]因此， 如何通过一次扩增 法即可实现对犬冠状病毒S基因全序列的扩增是本领域 技术人员亟需解决的问题。 发明内容 [0006]有鉴于此， 本发明提供了一种扩增犬冠状病毒S基因全序列的引物序列， 通过对 NCBI上已知全基因组CCoV毒株的S基因上、 下游比对， 筛选获得其上下游保守区域， 设计1对 引物， 实现犬冠状病毒S基因的全序列扩增， 操作便捷， 避免了在高变区域无法扩增获得目 的片段的风险。 [0007]为了实现上述目的， 本发明采用如下技 术方案：说　明　书 1/6 页 3 CN 115386655 A 3