(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210735481.5 (22)申请日 2022.06.27 (71)申请人 扬州大学 地址 225000 江苏省扬州市大 学南路88号 (72)发明人 李向东　余良政　侯闻闻　朱振邦　 刘盼娆　 (74)专利代理 机构 北京风雅颂专利代理有限公 司 11403 专利代理师 李翔 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种快速鉴别猪繁殖障碍症候群病原的 iiPCR试剂盒及其使用方法 (57)摘要 本发明涉及动物病毒学技术领域， 尤其涉及 一种快速鉴别猪繁殖障碍症候群病原的iiPCR试 剂盒及其使用方法， 试剂盒包括iiPCR扩增液， 所 述iiPCR扩增液包括引物探针组， 所述引物探针 组包括第一引物对和第一探针、 第二引物对和第 二探针、 第三引物对和第三探针、 第四引物对和 第四探针、 第五引物对和第五探针。 本发明针对 临床中猪的心、 肝、 脾、 肺、 肾、 淋巴结等病理组织 样品， 经核 酸提取， 直接将DNA或者RNA作为模板， 即可完成i iPCR检测。 权利要求书2页 说明书12页 序列表5页 CN 115261514 A 2022.11.01 CN 115261514 A 1.一种快速鉴别猪繁殖障碍症候群病原的iiPCR试剂盒， 包括iiPCR扩增液， 其特征在 于， 所述iiPCR扩增液包括引物探针组， 所述引物探针组包括第一引物对和第一探针、 第二 引物对和 第二探针、 第三引物对和第三探针、 第四引物对和 第四探针、 第五引物对和 第五探 针， 所述第一引物对包括如SEQ  ID NO.1所示的PRRSV上游引物和如SEQ  ID NO.2所示的 PRRSV下游引物， 所述第一探针包括如SEQ  ID NO.3所示的PRRSV探针， 所述第二引物对包括 如SEQ ID NO.4所示的PRV上游引物和如SEQ  ID NO.5所示的PRV下游引物， 所述第二探针包 括如SEQ ID NO.6所示的P RV探针， 所述第三引物对包括如SEQ  ID NO.7所示的CSFV上游引 物和如SEQ  ID NO.8所示的CSFV下游引物， 所述第三探针包括如SEQ  ID NO.9所示的CSFV探 针， 所述第四引物对包括如SEQ  ID NO.10所示的JEV上游引物和如SEQ  ID NO.11所示的JEV 下游引物， 所述第四探针包括如SEQ  ID NO.12所示的JEV探针， 所述第五引物对包括如SEQ   ID NO.13所示的PPV2上游引物和如SEQ  ID NO.14所示的PPV2下游引物， 所述第五探针包括 如SEQ ID NO.15所示的P PV2探针。 2.根据权利要求1所述快速鉴别猪繁殖障碍症候群病原的iiPCR试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还 包括阳性对照和阴性对照。 3.根据权利要求2所述快速鉴别猪繁殖障碍症候群病原的iiPCR试剂盒， 其特征在于， 所述阳性对照为进行灭活处理过的PRRSV、 PRV、 CSFV、 JEV、 PPV2病毒液， 接毒剂量为1 × 106TCID50/mL； 所述阴性对照为 Nuclease ‑free水。 4.根据权利要求1所述快速鉴别猪繁殖障碍症候群病原的iiPCR试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还 包括待测样品， 所述待测样品类型为猪的病理 组织。 5.根据权利要求4所述快速鉴别猪繁殖障碍症候群病原的iiPCR试剂盒， 其特征在于， 所述猪的病理 组织为心、 肝、 脾、 肺、 肾或淋巴结中的一种。 6.根据权利要求1所述快速鉴别猪繁殖障碍症候群病原的iiPCR试剂盒， 其特征在于， 所述iiPCR扩增液用量为48 μl， 添加模板量为2 μl， iiPCR扩增液包括(Premix缓冲 液)dNTP、 Tris‑Buffer、 EDTA、 DTT、 甘油和T ween‑20， 含量分别为0.5mM、 10mM、 0.05mM、 0.05mM、 30％V / V和0.1％V/V， Taq  DNA聚合酶的浓度0.1U/ μl、 MMLV反转录酶的浓度为0.5U/ μl， PRRSV上游 引物、 PRV上游引物、 CSFV上游引物、 JEV上游引物、 PPV2上游引物、 PRRSV下游引物、 PRV下游 引物、 CSFV下游引物、 JEV下游引物和PPV2下游引物的浓度均为1 μM， 第一探针、 第二探针、 第 三探针、 第四探针和第五探针的浓度均为0.0 5 μM， 所述模板为猪的病理 组织中提取的核酸。 7.根据权利要求1所述快速鉴别猪繁殖障碍症候群病原的iiPCR试剂盒， 其特征在于， 所述第一探针、 第二探针、 第三探针、 第四探针、 第五探针的5 ’端均使用FAM荧光报告基团， 3’端均使用MGB荧 光淬灭基团。 8.根据权利要求1 ‑7任一项所述快速鉴别猪繁殖障碍症候群病原的iiPCR试剂盒的使 用方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： 步骤一、 取 试剂盒中的i iPCR扩增液分装至i iPCR反应管中， 瞬时离心； 步骤二、 取待检样品加入到步骤一准备好的iiPCR反应管中， 瞬时离心后置入iiPCR仪 器； 步骤三、 选择520nm单通道荧光波长进行检测， 待iiPCR仪器反应结束后， 读取判定结 果。 9.根据权利要求8所述快速鉴别猪繁殖障碍症候群病原的iiPCR试剂盒的使用方法， 其权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115261514 A 2特征在于， 所述 iiPCR仪器采用手持式POCKIT  TM Micro Duo核酸分析仪 。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115261514 A 3