(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210747120.2 (22)申请日 2022.06.28 (71)申请人 上海市农业科 学院 地址 201403 上海市奉贤区金齐路10 00号 (72)发明人 赵志勇　赵兰馨　周昌艳　赵晓燕　 范婷婷　鄂恒超　李晓贝　张艳梅　 董慧　李旭娇　 (74)专利代理 机构 北京方圆嘉 禾知识产权代理 有限公司 1 1385 专利代理师 戴嵩玮 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称 一种快速鉴别毒红菇的LA MP引物组、 试剂盒 及检测方法 (57)摘要 本发明属于生物检测技术领域， 具体涉及一 种快速鉴别毒红菇的LA MP引物组、 试剂盒及检测 方法。 本发明提供了一种快速鉴别毒红菇的LAMP 引物组， 包 括正向外引物F3、 反向外引物B3、 正向 内引物FIP、 反向内引物BIP和环引物LB。 本发明 引物组特异性强， 灵敏度高， 可检测出浓度为 1pg/μL的毒红菇DNA， 并成功用于煮沸后的蘑菇 混合物(毒红菇含量低至1 ％)的检测， 具有快速、 灵敏、 特异和可视化的特点， 可用于毒红菇中毒 快速鉴别与溯源等。 权利要求书1页 说明书10页 序列表3页 附图4页 CN 114875174 A 2022.08.09 CN 114875174 A 1.一种快速鉴别毒红菇的LAMP引物组， 其特征在于， 包括正向外引物F3、 反向外引物 B3、 正向内引物FIP、 反向内引物BIP和环引物LB； 所述正向外引 物F3包括如SEQ  ID No.1所示的核苷酸序列； 所述反向外引 物B3包括如 SEQ ID No.2所示的核苷酸序列； 所述正向内引物FIP包括如SEQ  ID No.3所示的核苷酸序 列； 所述反向内引物BIP包括SEQ  ID No.4所示的核苷酸序列； 所述环引物LB包括如SEQ  ID  No.5所示的核苷酸序列。 2.权利要求1所述的引物组在制备 试剂盒和/或鉴别毒红菇中的应用。 3.一种快速鉴别毒红菇的LAMP试剂盒， 其特征在于， 包括权利要求1所述的引物组、 LAMP缓冲液、 酶反应液、 具有染色作用的试剂、 阳性对照和阴性对照； 所述具有染色作用的 试剂包括 荧光染料或显色剂。 4.根据权利要求3所述的试剂盒， 其特 征在于， 所述 LAMP缓冲液包括dNTPs和MgSO4溶液； 所述酶反应液包括Bst  DNA聚合酶； 所述荧光染料包括SYBR  Green； 所述显色剂包括HNB或酚红。 5.一种快速鉴别毒红菇的LAMP检测方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： 提取待测样品核酸， 利用权利要求1所述LAMP引物组对总DNA进行扩增反应， 并进行结 果判定。 6.根据权利要求5所述的检测方法， 其特征在于， 所述扩增反应的反应体系以10μL计， 包括： 2 μL核酸、 5 μL  2×LAMP变色预混液、 1.09 μL引物混合物和余 量的水。 7.根据权利要求6所述的检测方法， 其特征在于， 所述核酸的浓度为0.1～10ng/μL； 所 述引物混合物包括： 12.6～13.0 μM正向内引物FIP、 12.6～13.0 μM反向内引物BIP、 1.0～1.4 μM正向外引物F3、 1.0～1.4 μM反 向外引物B3、 6.2～6.6 μM环引物LB； 所述2 ×LAMP变色预混 液包括50mM氯化钾， 10mM硫酸铵， 3mM七水硫酸镁， 0.1％Tween ‑20， 100μM酚红染料， 0.8 μL   10mM的dNTPs， 0.l μL  8U/ μL的Bst 2.0 DNA聚合酶和余 量的水。 8.根据权利要求5所述的检测方法， 其特征在于， 所述扩增反应的温度为61～64℃， 时 间为20～45mi n。 9.根据权利要求5所述的检测方法， 其特征在于， 所述待测样品包括蘑菇子实体、 煮熟 蘑菇或呕吐物； 所述核酸包括基因 组DNA。 10.根据权利要求5所述的检测方法， 其特征在于， 所述结果判定的方法包括使用荧光 PCR仪或显色剂直接判定： 当使用荧光PCR仪时， 如在反应时间内出现S型扩增曲线为阳性， 无S型扩增曲线则为阴 性； 当使用HNB显 色剂时， 如颜色由紫罗兰变为 天蓝色为阳性， 颜色保持不变为阴性； 当使用 酚红显色剂时， 如颜色由酒红色变为黄色为阳性， 颜色保持不变为阴性。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114875174 A 2一种快速鉴别毒红菇的LAMP引物组、 试剂盒及检测方 法 技术领域 [0001]本发明属于生物检测技术领域， 具体涉及一种快速鉴别毒红菇的LAMP引物组、 试 剂盒及检测方法。 背景技术 [0002]毒红菇(Russula  emetica)， 又名呕吐红菇。 菌盖直径5～9厘米， 浅粉红至珊瑚红 色。 夏秋季在林中地上散生或群生， 广泛分布于我国西南地区。 毒红菇味道辛辣， 食后主要 引起急性胃肠炎型中毒症状。 误食后1～2小 时即可引起恶心、 呕吐、 腹泻、 腹痛， 肌肉抽搐， 脉搏加速， 严重的可因心脏衰弱或血液循环衰竭而引起死亡。 毒红菇的毒性在加热烹煮的 过程中能得到一定程度的消减， 但仍存在较高的毒性。 [0003]野生红菇， 又称为正 红菇、 真红菇、 红椎菌， 是一种珍稀野生食用菌。 因其营养丰富 且味道鲜美， 广受消费者喜爱。 野生红菇和毒红菇形态及其相似， 仅凭外观形态难以鉴别， 每年均有因错误分辨两种蘑菇而导致的中毒事件发生。 建立快速准确的鉴定方法对毒红菇 中毒的毒源鉴定与溯源具有重要意义。 目前已有多种技术用于毒蘑菇的鉴定， 如化学显色 法、 酶联免疫吸附测 定、 免疫层析法、 液相色谱 ‑质谱(LC‑MS)联用等。 不过以上方法存在或 是特异性不高， 或是依赖大型仪器、 操作繁琐等不足之处。 随着分子生物学的发展， 核酸扩 增技术已被应用于毒蘑菇的检测鉴定， 如聚合 酶链式反应(PCR)。 该技术反应过程依赖温度 循环仪器(PCR仪)， 反应时间约2小 时， 只能在实验室内完成， 难以满足现场速测的需求。 因 此， 实现毒红菇的快速检测仍是本行业亟 待解决的技 术问题。 发明内容 [0004]本发明的目的在于提供一种快速鉴别毒红菇的LAMP引物组、 试剂盒及检测方法， 快速准确地 鉴定毒红菇， 并且灵敏度高， 稳定性 好。 [0005]本发明提供了一种快速鉴别毒红菇的LAMP引物组， 包括正向外引物F3、 反向外引 物B3、 正向内引物FIP、 反向内引物BIP和环引物LB； [0006]所述正向外引物F3包括如SEQ  ID No.1所示的核苷酸序列； 所述反向外引物B3包 括如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列； 所述正向内引物FIP包括如SEQ ID  No.3所示的核苷 酸序列； 所述反向内引物BIP 包括SEQ ID No.4所示的核苷酸序列； 所述环引物LB包括如SEQ   ID No.5所示的核苷酸序列。 [0007]本发明还提供了上述技术方案所述的引物组在制备试剂盒和/或鉴别毒红菇中的 应用。 [0008]本发明还提供了一种快速鉴别毒红菇的LAMP试剂盒， 包括上述技术方案所述的引 物组、 LAMP缓冲液、 酶反应液、 具有染色作用的试剂、 阳性对照和阴性对照； 所述具有染色作 用的试剂包括 荧光染料或显色剂。 [0009]优选的， 所述 LAMP缓冲液包括dNTPs和MgSO4溶液； [0010]所述酶反应液包括Bst  DNA聚合酶；说　明　书 1/10 页 3 CN 114875174 A 3