(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211122559.2 (22)申请日 2022.09.15 (71)申请人 华中农业大 学 地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山 街1号 (72)发明人 张灿灿　李艳和　石瑞雪　张丹丹　 袁振东　文衍红　王志强　罗福广　 (74)专利代理 机构 武汉聚信汇智知识产权代理 有限公司 42 258 专利代理师 刘丹 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/385(2006.01) (54)发明名称 一种快速 检测鉴定铜绿假单胞菌的PCR方法 (57)摘要 本发明提供了一种快速检测鉴定铜绿假单 胞菌的PCR方法， 所述方法采用上游引物F： 5 ’ ‑ ATCTTCTCCGCGATGAGCTG ‑3’， 下游引物R： 5 ’ ‑ CGGGTTCTT CTTCAGCAGGT ‑3’， 进行PCR反应。 PCR反 应循环设置为： 94℃， 预变性5min； 94℃30s， 64℃ 30s， 72℃30s， 32个循环； 最后72℃延伸10min， 反 应结束。 本发 明在检测鉴定铜绿假单胞菌中具有 快速、 灵敏度高、 特异性强等特点； 也为三类病原 微生物铜绿假单胞菌的检测和鉴定提供了技术 手段， 同时还为铜绿假单胞菌和其他假单胞菌属 细菌的快速区别鉴别诊断提供了方法， 对于由铜 绿假单胞菌引起感染的早期诊断和鉴别具有重 要意义。 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 CN 115354085 A 2022.11.18 CN 115354085 A 1.一种快速检测鉴定铜绿假单胞菌的PCR方法， 其特征在于， 以DNA复制起始调控因子 dnaA基因为靶基因， 设计引物对铜绿假单胞菌的分子生物学特征进 行识别； 根据GenBank公 布的基因序列设计的引物为： 上游引物F： 5 ’ ‑ATCTTCTCCGCGATGAGCTG ‑3’ 下游引物R： 5 ’ ‑CGGGTTCTTCTTCAGCAGGT‑3’ PCR反应体系总体积为25 μL， 其中2 ×Hieff PCR Master Mix(with  Dye)(中国YEASEN 公司生产)12.5 μL， 上 下游引物各1 μL， 灭菌d dH2O 8.5 μL， DNA模板2 μL； PCR反应循环设置为： 94℃， 预变性5min； 94℃30s， 60 ‑64℃30s， 72℃30s， 32个循环； 最 后72℃延伸10mi n， 反应结束。 2.如权利 要求1所述的一种快速检测鉴定铜绿假单胞菌的PCR方法， 其特征在于， PCR反 应循环设置中： 退火温度设置为64℃。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115354085 A 2一种快速检测鉴定铜绿假单胞菌的PCR方 法 技术领域 [0001]本发明属于分子生物学检测鉴定领域， 具体涉及 一种快速检测鉴定铜绿假单胞菌 的PCR方法。 背景技术 [0002]铜绿假单胞菌(Pseudomonas  aeruginosa)在分类上属假单胞菌科 (Pseudomonadaceae)、 假单胞菌属(Pseudomonas  Migula)。 假单胞菌属现有包括荧光假单 胞菌(P.flu orescens)、 绿针假单胞菌(P.chlororaphi s)、 恶臭假单胞菌(P.putida)等12个 种。 铜绿假单胞菌广泛存在于土壤、 水、 植物及动物活动环境中。 人群活动场所与医院环 境， 特别是潮湿污秽的地方， 宜于此菌繁殖。 在医学领域， 铜绿假单胞菌被列入我国卫生部制定 的 《人间传染的病原微生物名录》 (2006)， 危害程度属第三类。 铜绿假单胞菌是一种人畜共 患病的机会性病原体， 对老年人或免疫功能低下 的人和牲畜具有严重的健康风险， 可引起 各种急慢性感染。 铜 绿假单胞菌是最重要最常见 的条件致病菌， 其是医院感染革兰阴性杆 菌的常见致病菌。 2020年中国细菌耐药监测铜 绿假单胞菌超越鲍氏不动杆菌， 占非发酵菌 首位， 占革兰阴性杆菌第三位， 耐药率和多 药耐药不断攀升以及高病死率， 为临床治疗带来 极大困惑， 进而严重威胁患者生命健康。 在兽医领域， 铜 绿假单胞菌可引起家禽、 家畜和宠 物的各种急慢 性感染， 例如中耳炎、 乳 腺炎、 子宫内膜炎、 出血性肺炎、 泌尿道和生殖道感染 等， 可发展成致死性腹泻、 菌血症和败血症等疾病， 极大地危害了动物健康， 给动物生产行 业造成了较大的经济损失。 同时， 铜绿假单胞菌及其代谢产生的毒物、 废物还可以通过直接 接触或食用肉类等方式传播给人体， 给人体健康带来了较大的风险。 另外， 近年来饮水和食 用菌栽培生产中假单 胞菌的污染与存在状况也越来越受到 重视。 [0003]我们在研究分析环棱螺 “腐壳病”的检测过程中发现， 在进行选择性平板分离培养 致病菌时， 铜 绿假单胞菌是主要致病菌。 根据铜绿假单胞菌的生化特性进行一系列的生化 和血清学鉴定的传统方法耗时且工作量大， 如果能在选择性平板分离培养后， 对疑似铜 绿 假单胞菌菌落采用分子生物学方法进 行铜绿假单胞菌的快速鉴别诊断， 无疑将提高环棱螺 是否患“腐壳病”的检测工作效率， 大大缩短后续生化和血清学鉴定所需的时间、 节省人力 和物力。 目前， 针对假单胞菌的分子生物学检测技术研究较为广泛， 有多种商品化试剂盒可 供选用， 但针对铜绿假单胞菌尚无较完善的分子生物学检测手段。 本发明提供的一种P CR快 速检测鉴定铜绿假单胞菌的方法， 将有助于满足医学临床检测工作需要和实际养殖生产中 快速检测工作需要， 具有重要理论 意义和实际应用价 值。 发明内容 [0004]本发明的目的在于提供一种PCR快速检测鉴定铜绿假单胞菌的方法， 本发明针对 铜绿假单胞菌传统分离鉴定方法无法满足医学临床检测工作需要和无法满足实际养殖生 产中快速检测工作需要这些不 足开展研究， 旨在提供一种快速、 灵敏度高、 特异 性强的检测 方法对铜绿假单 胞菌进行检测鉴定 。说　明　书 1/5 页 3 CN 115354085 A 3