(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210633135.6 (22)申请日 2022.06.06 (71)申请人 江苏省血 液中心 （江苏省医学生物 制品研究所） 地址 210042 江苏省南京市玄武区龙蟠路 179号 (72)发明人 林红　赵松　刘艳红　应清介　 杨坤　邵雷　 (74)专利代理 机构 南京经纬专利商标代理有限 公司 32200 专利代理师 唐循文 (51)Int.Cl. C12Q 1/6893(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12Q 1/6804(2018.01)C12N 15/11(2006.01) C12R 1/90(2006.01) (54)发明名称 一种快速检测疟原虫的核酸检测试剂盒及 其应用 (57)摘要 一种快速检测疟原虫的核酸检测试剂盒及 其应用， 试剂盒包含疟原虫上下游引物、 探针， 所 述上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如序 列表SEQ ID No.2和SEQ  ID No.3所示； 所述探针 的核苷酸序列如修饰后的序列表SEQ  ID No.4所 示。 本发明试剂盒可以快速、 灵敏地检测疟原虫， 无需昂贵的仪器设备， 试剂盒操作简单， 反应结 果易于观察， 特异性好， 非常适用于高危人群的 现场和经济条件欠发达的疟原虫流行区的筛查， 易于大范围推广使用。 权利要求书1页 说明书7页 序列表1页 附图4页 CN 114807404 A 2022.07.29 CN 114807404 A 1.一种快速检测疟原虫的核酸检测试剂盒， 其特征在于， 试剂盒包含疟原虫上下游引 物、 探针， 所述上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如序列表SEQ  ID No .2和SEQ ID No  .3所示； 所述探针的核苷酸序列如修饰后的序列表SEQ  ID No .4所示。 2.根据权利要求1所述快速检测疟原虫的核酸检测试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒包 括疟原虫RAA反应体系冻干粉， 反应缓冲液、 乙酸镁、 阳性质控品、 阴性质控品、 产物稀释液 和侧流层析 试纸条。 3.根据权利要求2所述快速检测疟原虫的核酸检测试剂盒， 其特征在于， 所述疟原虫 RAA反应体系冻干粉为RAA反应试剂、 10 μmol/  L的疟原虫上下游引物和探针 混匀冻干组装； 所述反应缓冲液的组份为： 50mM  pH7.4 Tris‑HCl 缓冲液、 10  wt.%的PEG  15000， 50  mM 氯 化钾， 5mM二硫苏糖醇， 10  wt.%的PEG  15000‑20000和 2.7ng/ μL的肌酸激酶； 所述乙酸镁的 浓度为240  mmol/L； 所述阳性质控品为含有疟原虫DNA片段的质粒； 所述阴性质控品组份为 ddH2O或纯化水； 所述产物稀释液为0.01mo l/L pH7.0 PBS。 4.权利要求1‑3任一所述试剂盒的应用， 其特征在于， 提取血液样品中总DNA； 进行重组 酶介导的扩增 （Recombinase  aided amplification， RAA） 反应； 采用测流层析试纸条 （Lateral  flow dipstick， LFD） 检测扩增产物。 5.根据权利要求4所述应用， 其特征在于， 所述重组酶介导的扩增反应体系为50μL， 包 括42.5μL反应缓冲液稀释的RAA反应单元冻干粉， 2.5μL  240 mmol/L的乙酸镁， 5μL模板 DNA。 6.根据权利要求4所述应用， 其特征在于， 所述重组酶介导的扩增反应条件为： 37℃的 避光恒温水浴锅或培 养箱中， 反应20mi n。 7.根据权利要求4所述应用， 其特征在于， 所述测流层析试纸条检测方法是： 取10μL   RAA扩增产物， 加至含有90 μL  PBS溶液的1.5mL离心管中， 混匀后将试纸条结合垫端插入离 心管中， 待判读区全部浸润， 将试纸条平放 1分钟， 等待红色条带出现， 根据试纸条显 色情况 直接读取检测结果。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114807404 A 2一种快速检测疟原虫的核酸检测试剂盒及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及 一种核酸等温扩增技术， 具体涉及一种快速检测疟原虫的核酸检测试 剂盒及其应用。 背景技术 [0002]疟原虫检测方法包括直接采用镜检方法查找疟原虫， 最有经验的镜检技术人员的 灵敏度是原虫(5 ‑50个)/mL； 常规实验室镜检灵敏度是500个疟原虫/mL， 确定阴性至少需要 20min， 适用于有感染症状者， 不能用于血站常规筛查， 也不适用于检测低滴度疟原虫感染 的无症状献血者， 血站也没有配备有经验的镜检技术人员应对每天几百到上千个标本。 抗 体筛查是目前用于选择性筛查献血者最为普遍的方法， 排除抗体阳性者献血是保证血液安 全的有效方法。 但疟原虫感染治愈后， 个体仍会长期存在抗体， 此方法也会屏蔽无疟原虫血 症献血者献血， 因此还需要采用P CR方法判定献血者是否有疟原虫血症。 据报道， PCR方法的 灵敏度可以低至0.25个疟原虫/mL， 但不是所有实验室 的PCR灵敏度都能达到这个程度。 如 果以1个疟原虫/mL计算， 1个单位血液(200 mL)就会有200个疟原虫， 这个数目足够免疫力低 下的受血者感染疟疾。 PCR方法操作复杂， 需要专门的操作人员和昂贵的热循环装置。 这两 种检测方法不能满足在献血现场对献血者进行血液筛查的快速、 准确、 特异性和灵敏度高 的要求。 [0003]为了适用现场检测的要求， 恒温扩增方法得到了广泛的应用， 其最大的优点是可 以在恒定的温度下发生反应。 应用恒温扩增技术检测 致病菌， 简单 的数字水浴锅可以取代 昂贵的PCR仪， 大大降低了检测成本。 恒温扩增方法主要包括环介导等温扩增(LAMP)、 滚环 扩增(RCA)、 解旋酶为基础的扩增(HDA)、 聚合 酶扩增(RPA)和重组酶扩增(RAA)。 在这些恒温 扩增方法中， RAA以操作简单、 反应温度低(37℃ ‑42℃)、 扩增所需时间短(5 ‑25min)而优于 其他的恒温扩增方法。 P CR是通过传统检测恒温扩增产 物的方法是使用琼脂糖凝胶电泳， 该 方法耗时长， 并且需要凝胶成像系统， 不符合病原体现场检测简便、 快速的要求。 侧向流动 免疫层析试纸条(侧流层析试纸条， Lateral  flow dipstick， LFD)是20世纪90年代发展起 来的一项新型体外诊断技术。 试纸条制作简单， 价格便宜， 使用方便， 并且保存期 长。 目前采 用等温扩增技术检测疟原虫的方法多有报道， 但将RAA 技术与LFD结合起来检测疟原虫的分 析方法未见报道。 该技术操作简单快速， 结果容易判定， 无需复杂的仪器和专业的技术人 员， 具有很强的现场应用价 值。 通过检索， 尚未发现与本发明申请相关的专利公开文献。 发明内容 [0004]解决的技术问题： 本发明的目的在于克服现有技术的不足之处， 提供一种快速检 测疟原虫的核酸检测试剂盒及其应用。 [0005]技术方案： 一种快速检测疟原虫的核酸检测试剂盒， 试剂盒包含疟原虫上下游引 物、 探针， 所述上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如序列表SEQ  ID No.2和SEQ  ID  No.3所示； 所述探针的核苷酸序列如修饰后的序列表SEQ  ID No.4所示。说　明　书 1/7 页 3 CN 114807404 A 3