(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210744966.0 (22)申请日 2022.06.27 (71)申请人 河北省动物疫病预防控制中心 地址 050035 河北省石家庄市高新区阿里 山大街219号 (72)发明人 韩庆安　王建昌　王金凤　孟宪华　 马宏伟　顾文源　韩荞忆　张倩　 (74)专利代理 机构 河北国维致远知识产权代理 有限公司 13137 专利代理师 张新利 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种快速检测猪轮状病毒的引物和探针、 试 剂盒及其使用方法 (57)摘要 本发明涉及病毒检测技术领域， 具体公开一 种快速检测猪轮状病毒的引物和探针、 试剂盒及 其使用方法。 引物和探针的序列为： 上游引物为 SEQ ID NO:1； 下游引物为SEQ  ID NO:2； 探针的 序列为SEQ  ID NO:3。 本发明引物和探针的灵敏 度高， 最低检测 限能达到13拷贝/μL， 用于RT ‑ RPA检测方法中， 恒温条件下仅需要2 0min即可完 成反应， 且 结合测流层析试纸条可 实现肉眼可视 化RPA检测猪轮状病毒， 有利于对猪轮状病毒的 早期快速诊断， 同时， 对仪器设备的要求低， 实现 了在非实验室条件下快速直观检测猪轮状病毒 的目的， 适用于野外现场检测， 对猪场一线PoRV 的快速诊断和防控具有十分重要的意 义。 权利要求书1页 说明书7页 序列表1页 附图3页 CN 115011737 A 2022.09.06 CN 115011737 A 1.一种快速检测猪 轮状病毒的引物和探针， 其特 征在于： 所述引物的序列为： 上游引物： 5 ′ ‑GGGACTATGTG GATTAATGCTGGGTCAGA‑3′； 下游引物： 5 ′ ‑CAACAGAAATTCAACTTCTACATTACTTGGTC‑3′； 所述探针的序列为： 5 ′ ‑AGACGTGCACTTACGACAGCTACAATTACT ‑THF‑TGCTACCAGATGCTG ‑ 3′。 2.如权利要求1所述的引物和探针， 其特征在于： 所述下游引物的5 ′端标记有生物素， 所述探针的5 ′端标记有荧 光素， 3′端进行封闭修饰。 3.如权利要求2所述的引物和探针， 其特征在于： 所述荧光基团为FAM， 所述封闭修饰为 C3‑spacer修饰； 经 过所述标记和修饰的探针为： 5 ′ ‑FAM‑ AGACGTGCACT TACGACAGCTACA ATTACT‑THF‑TGCTACCAGATGCTG ‑C3‑spacer‑3′。 4.权利要求1 ‑3任一项所述的引物和探针在非诊断性检测猪 轮状病毒中的应用。 5.一种检测猪轮状病毒的试剂盒， 其特征在于： 包含权利要求1 ‑3任一项所述的引物和 探针。 6.如权利要求5所述的试剂盒， 其特征在于： 还包括基础缓冲液、 醋酸镁溶液、 RPA冻干 粉和去离 子水。 7.权利要求6所述的试剂盒的使用方法， 其特征在于： 具体操作为： 提取待测样品的基 因组为模板， 用所述试剂盒进行RT ‑RPA扩增， 并在扩增结束后进行侧流层析 试纸条检测。 8.如权利 要求7所述的试剂盒的使用方法， 其特征在于： 所述RT ‑RPA扩增体系包括以下 试剂及用量： 9.如权利 要求8所述的试剂盒的使用方法， 其特征在于： 所述RT ‑RPA扩增体系的扩增条 件为： 42‑44℃， 20‑25min。 10.如权利要求9所述的试剂盒的使用方法， 其特征在于： 所述RT ‑RPA扩增体系的扩增 条件为： 43℃， 20mi n。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115011737 A 2一种快速检测猪轮状病毒 的引物和探针、 试剂盒及其使用 方法 技术领域 [0001]本发明涉及病毒检测技术领域， 尤其涉及一种快速检测猪轮状病毒的引物和探 针、 试剂盒及其使用方法。 背景技术 [0002]猪轮状病毒(Porcine  Rotarvirus， PoRV)是呼肠孤病毒科、 轮状病毒属成员， 抵抗 力较强， 在室温环境条件 下能够存活7个月， 对一般温度、 消毒 药和酸碱度有一定的抵抗力。 PoRV对各年龄猪均易 感， 是仔猪腹泻的主要病原之一， 且1周龄以内仔猪感染后症状最为严 重， 病死率可达80％以上， 给我国畜牧业的发展和规模化猪场的正常经营造成了严重的阻 碍。 PoRV为含11个双链RNA的双股RNA病毒， 其中VP6基因所编码的Cap蛋白是PoRV的核心蛋 白， 是参与介导病毒黏膜免疫反应的特异性抗原， 占病毒蛋白的50％以上。 VP6基因在不同 地区PoRV分离株中高度保守， 其病毒检测、 分型及免疫性保护过程中具有重要的诊断学意 义。 [0003]目前， 对PoRV的检测方法主要有传统的病原分离鉴定、 酶联免疫吸附试验 (ELISA)、 病毒中和试验(VNT)、 免疫电镜法、 RT ‑PCR等， 但用于PoRV临床快速检测上存在耗 时长、 成本高、 技术复杂等局限。 重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase  polymerase   amplification， RPA)是一种核酸恒温扩增技术， 现被广泛应用于人和动物病原核酸的快速 检测。 但是， RPA检测方法对引物和探针的要求较为苛刻， 且PoRV的临床症状及病变特征与 猪流行性腹泻病毒(PEDV)、 猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、 猪delta冠状病毒(PDCoV)、 猪繁殖 与呼吸综合征病毒(PRRSV)、 猪瘟病毒(CSFV)、 猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)相 似， 仅通过 临床症状和病理变化中非常容易误诊， 造成较大的经济损失或者疫情的扩散等。 因此， 发展一种简便、 高特异性、 高灵敏度的PoRV快速检测方法， 对早期防治PoRV具有十分 重要的意 义。 发明内容 [0004]针对现有猪轮状病毒的检测方法存在检测方法复杂、 耗时长、 检测条件要求苛刻 及检测效率低的问题， 本发明提供一种 快速检测猪轮状病毒的引物和探针、 试剂盒及其使 用方法。 [0005]为达到上述发明目的， 本发明实施例采用了如下的技 术方案： [0006]一种快速检测猪 轮状病毒的引物和探针， 所述引物的序列为： [0007]上游引物： 5 ′ ‑GGGACTATGTG GATTAATGCTGGGTCAGA‑3′(SEQ ID NO:1)； [0008]下游引物： 5 ′ ‑CAACAGAAATTCAACTTCTACATTACTTGGTC‑3′(SEQ ID NO:2)； [0009]所述探针的序列为： 5 ′ ‑AGACGTGCACTTACGACAGCTACAATTACT ‑THF‑ TGCTACCAGATGCTG ‑3′(SEQ ID NO:3)。 [0010]相对于现有技术， 本发明提供的检测猪轮状病毒的引 物和探针， 可以特异性的结说　明　书 1/7 页 3 CN 115011737 A 3