(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210620803.1 (22)申请日 2022.06.02 (71)申请人 江苏师范大学 地址 221000 江苏省徐州市铜山 新区上海 路101号 (72)发明人 豆保婷　周慧　王颇　 (74)专利代理 机构 徐州千秋知识产权代理事务 所(普通合伙) 32556 专利代理师 周敏 (51)Int.Cl. C12Q 1/6806(2018.01) C12Q 1/6825(2018.01) C12Q 1/682(2018.01) C12N 15/11(2006.01) G01N 27/327(2006.01)G01N 27/416(2006.01) B22F 1/18(2022.01) B22F 9/24(2006.01) (54)发明名称 一种快速、 灵敏检测DNA甲基化的高效DNA步 行器的构建方法与应用 (57)摘要 本发明公开了一种快速、 灵敏检测DNA甲基 化的高效DNA步行器的构建方法与应用， 包括： 制 备双金属MOF材料； 设计高效的DNA步行器； 将双 金属MOF材料进行核酸功能化； 构建电化学传感 界面， 检测DNA 的甲基化状态。 本发明中快速、 灵 敏检测DNA甲基化的高效DNA步行器， 利用DNA链 转移介导的链置换反应， 结合双金属MOF材料的 高催化性能， 构建了快速、 灵敏的DNA甲基化电化 学传感平台， 可以识别不同甲基化程度的DNA， 对 相关临床疾病的早期诊断及遗传信息机理研究 具有重要意 义。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图3页 CN 115011667 A 2022.09.06 CN 115011667 A 1.一种快速、 灵敏检测DNA甲基化的高效DNA步行器的构建方法， 其特征在于， 包括以下 步骤： S1： 首先用溶剂热法合成NiCo ‑MOF， 进一步在NiCo ‑MOF表面包覆金纳米粒子得到Au@ NiCo‑MOF； S2： 将巯基修饰的燃料探针FP与Au@NiCo ‑MOF混合反应， 制得功能化的FP/Au@NiCo ‑ MOF； S3： 对金电极AuE进行表面预处理， 将巯基修饰的固定探针IP固定到金电极AuE表面， 并 用巯基己醇M CH进行封闭得到 MCH/IP/AuE， 作为DNA步行器的轨道； S4： 将不同甲基化 程度的DNA滴加到 MCH/IP/AuE界面上， 启动DNA步行器。 2.根据权利 要求1所述的一种快速、 灵敏检测 DNA甲基化的高效DNA步行器的构 建方法， 其特征在于， 所述步骤S1具体包括： 将2,5 ‑二羟基对苯二甲酸、 镍的无机盐、 钴的无机盐和 聚乙烯吡咯烷酮溶解到二甲基甲酰胺中， 然后将混合溶液置于反应釜中， 于120℃下反应24 小时； 冷却至 室温后， 充分洗涤干燥， 获得NiCo ‑MOF样品； 以氯金酸为前驱体、 硼氢化钠为还 原剂、 聚乙烯吡咯烷酮为表面活性剂制备纳米金胶体颗粒， 并与NiCo ‑MOF交联得到Au@ NiCo‑MOF。 3.根据权利 要求2所述的一种快速、 灵敏检测 DNA甲基化的高效DNA步行器的构 建方法， 其特征在于， 所述镍的无机盐为 NiCl2或NiNO3， 所述钴的无机盐为CoCl2或CoNO3。 4.根据权利 要求1所述的一种快速、 灵敏检测 DNA甲基化的高效DNA步行器的构 建方法， 其特征在于， 所述步骤S2具体包括： 将巯基修饰的燃料探针FP与三(2 ‑羧乙基)膦反应60分 钟以打开双硫键， 随后与Au@NiCo ‑MOF(1mg/mL)反应12小时， 从而得到FP/Au@NiCo ‑MOF； 其 中所述燃料探针FP的序列 为5′ ‑TCACAACGTCTACACATGGCGTTGTGATAGAGTATCCATGTGTAGACTG AATCGA‑(CH2)6‑SH‑3′。 5.根据权利 要求1所述的一种快速、 灵敏检测 DNA甲基化的高效DNA步行器的构 建方法， 其特征在于， 所述步骤S3具体包括： 将巯基修饰的固定探针IP与三(2 ‑羧乙基)膦反应60分 钟以打开双 硫键， 随后滴加到处理好的金电极表面， 在避光条件下孵育12小时， 冲洗过后再 将巯基己醇滴加到传感界面上封闭2小时， 从而得到MCH//IP/AuE， 其中所述巯基修饰的固 定探针IP的序列为5 ′ ‑SH‑(CH2)6‑ACTACTTCTCGATTCAATACTCTATCACAACGCCAT GTGTAGACGTTG TGATAGAGTAT ‑3′。 6.根据权利 要求1所述的一种快速、 灵敏检测 DNA甲基化的高效DNA步行器的构 建方法， 其特征在于， 所述步骤S4具体包括： 将不同甲基化程度的DNA样品和FP/Au@NiCo ‑MOF同时滴 加到MCH/IP/AuE表面， 室温反应20分钟， 其中所述DNA的序列为5 ′ ‑mCGTTGTGATAGAGTATTGA ATmCGAGA AGTAGT‑3′。 7.权利要求1至 6任一项所述的构建方法得到的DNA步行器。 8.权利要求7 所述的DNA步行器在检测DNA甲基化方面的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115011667 A 2一种快速、 灵敏检测DNA甲 基化的高 效DNA步行器的构建 方法 与应用 技术领域 [0001]本发明涉及电化学生物传感器领域， 具体涉及一种快速、 灵敏检测DNA甲基化的高 效DNA步行器的构建方法与应用。 背景技术 [0002]DNA甲基化是指DNA甲基转移酶以S腺苷甲硫氨酸作为甲基供体对CpG岛上的胞嘧 啶分子的5位端碳原子进行催化， 通过共价键引入一个甲基基团的表观遗传修饰。 DNA异常 甲基化状态与多种疾病的产生和发展密切相关， 包括肿瘤细胞的形成和 生长、 控制肿瘤抑 制基因的活性表达等。 因此， DNA甲基化可以作为临床 检测的重要 标志物， 有效检测DNA甲基 化对于疾病的早期诊断及遗传机理研究具有重要的意 义。 [0003]DNA步行器作为一种经典的DNA分子机器， 具有高效的自组装纳米结构、 货物装卸 能力和生物模拟现象等优点， 其作为一种信号放大方法引起了科学家的广泛关注。 但传统 的DNA步行器的步行效率并不理想， 其中一个原因是 因为行走链 容易从轨道脱落， 在样品中 四处游荡不能有效的进行反应和信号放大， 进一步限制了步行器在 疾病标志物检测中的应 用效果。 此外， MOF材料有序的孔道结构使得其金属活性位点具有相同的微环境， 有利于提 高催化反应的选择性， 从而在电化学催化方面具有重要的价值。 研究表明， 与单金属MOF相 比， 双金属或多 金属MOF表现出更高的导电性、 增强的催化活性和可调节的电化学活性等优 势。 同时MOF作为载体携带DNA链， 可以有效提高DNA链的有效浓度， 从而增强DNA步行器的步 行效率。 发明内容 [0004]本发明的目的是提供一种快速、 灵敏检测DNA甲基化的高效DNA步行器的构建方 法， 能够提高DNA步行器的步行效率， 减少运作时间， 实现DNA甲基化的快速、 灵敏检测。 [0005]为实现上述目的， 本发明采用的技 术方案如下： [0006]第一方面， 本发明提供一种快速、 灵敏检测DNA甲基化 的高效DNA步行器的构建方 法， 包括以下步骤： [0007]S1： 首先用溶剂热法合成NiCo ‑MOF， 进一步在NiCo ‑MOF表面包覆金纳米粒子得到 Au@NiCo‑MOF； [0008]S2： 将巯基修饰的燃料探针FP与Au@NiCo ‑MOF混合反应， 制得功能化的FP/Au@ NiCo‑MOF； [0009]S3： 对金电极AuE进行表面预处理， 将巯基修饰的固定探针IP固定到金电极AuE表 面， 并用巯基己醇M CH进行封闭得到 MCH/IP/AuE， 作为DNA步行器的轨道； [0010]S4： 将不同甲基化 程度的DNA滴加到 MCH/IP/AuE界面上， 启动DNA步行器； [0011]S5： 将反应后的传感界面作为工作电极， 与Ag/AgCl参比电极和铂丝对电极构成三 电极体系， 置 于磷酸盐缓冲溶 液和氮气氛围中进行电化学检测。说　明　书 1/4 页 3 CN 115011667 A 3