(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210615479.4 (22)申请日 2022.06.01 (71)申请人 四川大学华西医院 地址 610041 四川省成 都市武侯区国学巷 37号 (72)发明人 王成成　 (74)专利代理 机构 重庆信必达知识产权代理有 限公司 5 0286 专利代理师 李小伟 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种异质 性耐药细菌中碱基杂合的检测方 法 (57)摘要 本发明属于细菌基因检测技术领域， 公开了 一种异质性耐药细菌中碱基杂合的检测方法， 对 二代测序发现的phoP ‑phoQ基因突变位点的两端 设计引物， 并进行高保真PCR产物扩增； 将包含 phoP‑phoQ基因突变位点的PCR产物进行500万 × 超深度二代测序。 本发明从遗传学层面阐释细菌 单克隆异质性耐药的机制， 提供了一种具体的能 够检测细菌基因组10‑3及以下频率的不同碱基 杂合的方法和流程， 从而发现杂合形成的遗传学 差距。 本发明创新地开展了一种针对phoP ‑phoQ (或者其他目的基因)超深度测序方法， 可以准确 检测细菌 单克隆中phoP ‑phoQ基因的同一个位点 存在的碱 基杂合， 从而阐释异质性耐药机制。 权利要求书1页 说明书12页 序列表6页 附图2页 CN 115125314 A 2022.09.30 CN 115125314 A 1.一种异质性耐药细菌中碱基杂合的检测方法， 其特征在于， 所述异质性耐药细菌中 碱基杂合的检测方法对二代测序 发现的phoP‑phoQ基因突变位点的两端设计引物， 进行高 保真PCR产物扩增， 然后将包含phoP ‑phoQ基因突变位点的PCR产物进行500万(106)×超深 度二代测序； 包括： 利用针对phoP ‑phoQ超深度测序方法， 检测细菌单克隆中phoP ‑phoQ基因的同一个位点 存在的碱基杂合， 从而确定异质性耐药机制。 2.如权利要求1所述异质性耐药细菌中碱基杂合的检测方法， 其特征在于， 所述基因还 包括其他目的基因。 3.如权利要求1所述异质性耐药细菌中碱基杂合的检测方法， 其特征在于， 所述异质性 耐药细菌中碱基杂合的检测方法包括以下步骤： 步骤一， 对二代测序发现的phoP ‑phoQ基因突变位 点的两端设计引物； 步骤二， 进行高保真PCR产物扩增； 步骤三， 将包 含phoP‑phoQ基因突变位 点的PCR产物进行5 00万×超深度二代测序。 4.如权利要求3所述异质性耐药细菌中碱基杂合的检测方法， 其特征在于， 所述步骤一 中的PCR产物长度为3 00bp。 5.如权利要求3所述异质性耐药细菌中碱基杂合的检测方法， 其特征在于， 所述步骤二 中的超深度二代测序为5 ×106。 6.如权利要求3所述异质性耐药细菌中碱基杂合的检测方法， 其特征在于， 所述步骤二 中进行高保真PCR产物扩增； PCR反应体系(25μl)： 高保真PCR聚合酶 12.5μ l； ddH2O 8.5 μl； 引物_up  1 μl； 引物_dw  1 μl； DNA模板2 μl。 7.如权利要求3所述异质性耐药细菌中碱基杂合的检测方法， 其特征在于， 所述步骤二 中PCR反应条件： 8.如权利要求3所述异质性耐药细菌中碱基杂合的检测方法， 其特征在于， 所述步骤三 中PCR产物测序步骤： DNA检测、 文库构建、 文库质量检测、 上机测序、 质量控制。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115125314 A 2一种异质性耐药细菌中碱基 杂合的检测方 法 技术领域 [0001]本发明属于细菌基因检测技术领域， 尤其涉及一种异质性耐药细菌中碱基杂合的 检测方法。 背景技术 [0002]异质性耐药(Heteroresist ance,HR)因其普遍性， 难以检测和治疗困难等特征给 临床感染控制带来极大挑战。 HR是细菌耐药的一种 特殊类型， 指同一细菌群体在抗菌药敏 感性方面表现出表型的不同， 其中部分亚群的最低抑菌浓度(MIC)高于细菌的主要菌群。 HR 在多种不同的细菌种类和抗菌药物类别中十分普遍且其耐药表型复杂。 其主要敏感亚群中 存在少部 分耐药亚群， 通常HR菌株在抗菌药物存在时， 耐药亚群富集， 但没有抗菌药物压力 时， 容易迅速恢复敏感。 这是HR区别于我们熟知的经典耐药的一个重要 特点， 这也导致体外 药敏检测通常将其判断为敏感细菌而影响临床抗菌药物的初始选择。 异质性耐药成因和表 象复杂且具有临床意 义， 其分子 机制研究是细菌耐药基础研究的一个前沿方向。 [0003]目前， 针对细菌开展的二代全基因组测序可以检测发生在基因组中的基因突变、 丢失、 插入等。 但是普通的二代全基因组测序深度一般为500 ×以内， 仅分析基因组序列可 能会遗漏同一位点发生率在10‑3及以下频率的不同碱基杂合现象， 而不 能发现杂合形成的 遗传学差距。 [0004]通过上述分析， 现有技术存在的问题及缺陷为： 普通的二代全基因组测序方法中， 仅分析基因组序列 可能会遗漏同一位点发生率在10‑3及以下频率的不同碱基杂合现象， 而 不能发现杂合形成的遗传学差距。 发明内容 [0005]针对现有技术存在的问题， 本发明提供了一种异质性耐药细菌中碱基杂合的检测 方法。 [0006]本发明是这样实现的， 一种异质性耐药细菌中碱基杂合的检测方法， 所述异质性 耐药细菌中碱基杂合的检测方法包括： 对二代测序 发现的phoP‑phoQ基因突变位点的两端 设计引物， 进行高保真PCR产物扩增， 然后将包含phoP ‑phoQ基因突变位点的PCR产物进行 500万(106)×超深度二代测序； [0007]针对phoP ‑phoQ基因特定位点进行超深度测序方法， 检测细菌单克隆中p hoP‑phoQ 基因的同一个位 点存在的碱基杂合， 从而确定异质性耐药机制。 [0008]进一步， 所述基因还包括其他任何试图检测的目的基因， 例如mgrB,tolC,arnA等 基因。 [0009]进一步， 所述异质性耐药细菌中碱基杂合的检测方法包括以下步骤： [0010]步骤一， 对二代测序发现的phoP ‑phoQ基因突变位 点的两端设计引物； [0011]本发明针对不同菌株的phoP ‑phoQ基因的不同突变位点两端分别在primer3网站 上设计以下引物： 引物设计具体步骤如下：说　明　书 1/12 页 3 CN 115125314 A 3