(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210980622.X (22)申请日 2022.08.16 (71)申请人 江苏省农业科 学院 地址 210014 江苏省南京市孝陵卫钟灵街 50号 (72)发明人 闫乐艳　陈哲　孙雪峰　周慧　 郭彬彬　戴子淳　 (74)专利代理 机构 南通一恒专利商标代理事务 所(普通合伙) 32553 专利代理师 梁金娟 (51)Int.Cl. C12Q 1/6879(2018.01) C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种幼雏鸽性别鉴定方法及鉴定用PCR引物 (57)摘要 本发明提供一种用于快速鉴定幼雏鸽性别 的引物、 试剂及方法， 引物针对雌性鸽W染色体上 特有的EE0.6序列片段设计， 并利用Biotin和FAM 修饰。 检测时， 首先使用高效核酸裂解液快速提 取羽髓中的DNA， 简化了DNA的获得过程； 然后经 过上述引物特异性PCR扩增， 将 扩增的PCR产物通 过胶体金试纸条有无条带来实现雌性个体鉴定 的快速检测， 结果直观清晰， 辨识度高， 极易 分辨 出鸽性别， 验证结果与胶体金试纸结果一致， 准 确率为100％。 利用所述PCR ‑胶体金试纸技术和 基因分型方法确定鸽性别的方法， 具有特异性 强、 准确率高、 操作 简单方便、 鉴别结果快速准确 以及对动物伤害小等优点， 降低了鸽性别鉴定的 时间和经济成本， 便于基层推广和使用， 具有广 阔的市场应用前 景。 权利要求书1页 说明书4页 附图4页 CN 115287342 A 2022.11.04 CN 115287342 A 1.一种幼雏鸽性别鉴定方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： S1、 拔取乳鸽身上 带有毛囊的新 生羽毛1‑2根； S2、 利用基因组DNA提取试剂提取待测乳鸽的基因组DNA， 操作步骤如下： 将裂解液A与 裂解液B按照24： 1混合， 然后将带有羽髓的羽毛样品加入混合好的裂解液中， 55℃加热15 分 钟， 95℃加热5分钟， 再加入终止液， 取 上清液即获得鸽羽髓的基因 组DNA； S3、 以提取的DNA为模板， 利用Biotin和 FAM修饰的特异性上下游引物进行PCR扩增； 其 中， PCR反应体系为： 2 ×Taq Master Mix 10 μL， 浓度为10 μmol/L的正向和反向引物各0.8 μ L， 模板DNA  1 μL， 超纯水7.4 μL； PCR反应程序为： 9 5℃预变性3min； 延伸按9 5℃15s， 60℃15s， 72℃60s进行30个循环； 72℃保温5mi n； 4℃结束。 S4、 取1‑2 μL扩增的PCR引物用胶体金试纸条专用样品稀释液稀释50 ‑100倍后， 取50μL 加入胶体金试纸条的加样孔， 反应2 ‑5min， 雄性乳鸽对应的试剂反应后只在胶体金试纸条 的质控线上出现一条条带， 检测线处无条带； 雌性乳鸽对应的试剂反应后在胶体金试纸条 的质控线和检测线上 各出现一条 条带， 以此鉴定 乳鸽的性别。 2.一种幼雏鸽性别鉴定用PCR引物， 其特 征在于， 包括： 上游引物序列： TC CTATGCCTACCACCTTCCT； 下游引物序列： T TGAGAAAGAATCTGACCTGAACC。 3.如权利要求2所述的幼雏鸽性别鉴定用PCR引物在幼雏鸽性别鉴定中的应用。 4.如权利要求2所述的幼雏鸽性别就鉴定用PCR引物在制备幼雏鸽性别鉴定用试剂盒 中的应用。 5.一种幼雏鸽性别鉴定用试剂 盒， 其特征在于， 包括如权利要求2所述的幼雏鸽性别鉴 定用PCR引物， 还包括： 基因组DNA提取试剂、 2 ×Taq Master Mix、 超纯水、 胶体金试纸条专 用样品稀释液。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115287342 A 2一种幼雏鸽 性别鉴定方 法及鉴定用PCR引物 技术领域 [0001]本发明属于生物技 术领域， 具体涉及一种幼雏鸽性别鉴定方法及鉴定用PCR引物。 背景技术 [0002]中国养鸽业发展迅猛， 但由于科研力量投入不足以及鸽子特有的生物学特性， 肉 鸽养殖技术落后于其他家禽， 其中种鸽生产上 的性别鉴定难题仍待解决。 性别鉴定在鸽子 育种和控制 养殖成本中尤为重要。 不同性别的个体其营养需求不同， 性别的早期鉴定将有 助于节约饲养成本， 提高养殖效率。 对于种鸽来说， 需要合理的性别比例， 如果性别比例不 当， 不利于繁殖育种。 如果在早期就能够 对鸽子准确地分离出性别并进 行及时地配对， 不仅 能提高鸽场的生产效率， 增加生产效益， 还能及早淘汰不必 要的雄鸽减少生产成本， 尤其在 幼鸽期去公 留母， 在蛋鸽产业中更为突出， 因此， 早期的性别鉴定有重要实践意义和经济价 值。 [0003]但是鸽子属于性别单态鸟， 无论是雏鸽还是成年鸽都很难 从外观形态或其他行为 上加以区分， 此外， 鸽子是晚成鸟， 出生雏不能像一般家禽通过翻 肛方式进行性别鉴定。 目 前， 在幼雏鸽性别鉴定方面， 主要是通过外貌行为特征、 腹腔镜检、 粪便类固醇检测及核型 等方法进行鸽性别鉴定， 但这些方法准确率不高， 鉴定过程繁琐， 难以在生产上大规模推 广。 在鸽上应用翻肛法时其正确率只有 70％左右。 随着分子生物学的发展， 针对鸽性别鉴定 可以选择一些分子生物学方法， 具有准确性高、 对动物伤害较小等优点。 但已报道的鉴定方 法大多需繁琐的基因组抽提步骤， 还需琼脂糖凝胶电泳胶分析结果， 很难在生产上推广应 用。 发明内容 [0004]本发明要解决的技术问题是提供一种幼雏鸽性别鉴定方法及鉴定用PCR引物， 能 简单、 快速、 准确地 鉴别幼雏鸽的性别。 [0005]为解决上述技术问题， 本发明的实施例提供一种幼雏鸽性别鉴定方法， 包括如下 步骤： [0006]S1、 拔取乳鸽身上 带有毛囊的新 生羽毛1‑2根； [0007]S2、 利用基因组D NA提取试剂 提取待测乳鸽的基因组DNA， 操作步骤如下： 将裂解液 A与裂解液B按照24： 1混合， 然后将带有羽髓的羽毛样 品加入混合好的裂解液中， 55℃加热 15分钟， 95℃加热5分钟， 再加入终止液， 取 上清液即获得鸽羽髓的基因 组DNA； [0008]S3、 以提取的DNA为模板， 利用Biotin和FAM修饰的特异性上下游引物进行PCR扩 增； 其中， PCR反应体系为： 2 ×Taq Master Mix 10 μL， 浓度为10 μmol/L的正向和反向引物各 0.8 μL， 模板DNA  1 μL， 超纯水7.4 μL； PCR反应程序为： 95℃预变性3min； 延伸按9 5℃15s， 60℃ 15s， 72℃6 0s进行30个循环； 72℃保温5mi n； 4℃结束。 [0009]S4、 取1‑2 μL扩增的PCR引物用胶体金试纸条专用样品稀释液稀释50 ‑100倍后， 取 50 μL加入胶体金试纸条的加样孔， 反应2 ‑5min， 雄性乳鸽对应的试剂反应后只在胶体金试说　明　书 1/4 页 3 CN 115287342 A 3