(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210593957.6 (22)申请日 2022.05.27 (71)申请人 南京邮电大 学 地址 210046 江苏省南京市栖霞区文苑路9 号 (72)发明人 吴鸿宇　朱丹　汪联辉　晁洁　 马子豪　张成文　 (74)专利代理 机构 南京经纬专利商标代理有限 公司 32200 专利代理师 强萌 (51)Int.Cl. C12Q 1/6818(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种多组分核酸酶嵌合的框架核酸探针及 其制备方法和应用 (57)摘要 本发明公开了一种多组分核酸酶嵌合的框 架核酸探针及其制备方法和应用， 该框架核酸探 针的结构为四面体结构， 包括DNA四面体和 MNAzyme组件， MNAzyme组件通过链杂交与DNA四 面体进行连接。 将等摩尔比的荧光标记的DNA四 面体探针序列及MNAzyme组件混合， 通过热退火 实现结构自组装， 得到该框架核酸探针。 探针中 的荧光分子的荧光被淬灭分子淬灭， 探针在被激 发光激发时不发荧光。 将该探针与不同的目标核 酸分子孵育后， 探针可以与特定的核酸分子结 合， 形成具有催化活性的核酸酶结构， 激活核酸 酶中的活性位点发生断裂， 导致荧光链的断裂与 释放， 可实现目标核酸分子的灵敏检测， 在癌症 临床诊断和预后研究中有广泛的应用前 景。 权利要求书2页 说明书7页 序列表2页 附图3页 CN 114958973 A 2022.08.30 CN 114958973 A 1.一种多组分核酸酶嵌合的框架核酸探针， 其特征在于， 所述框架核酸探针的结构为 四面体结构， 包括DNA四面体和MNAzyme组件， MNAzyme组件通过链杂交与DNA四面体进行连 接； 其中， 所述DNA四面体由四条DNA四面体探针S1、 S2、 S3、 S4通过链杂交的方式进行连接 形成， 所述DNA四面体的一个顶点通过链杂交的方式与底物链Sub、 连接链E形成MNAzyme组 件； 所述MNAzyme组件包括靶标识别域、 催化域和底物域， 所述MNAzyme组件上的催化域和 底物域通过链杂交的方式与DNA四面体顶点的延伸域进行 连接。 2.根据权利要求1所述的一种多组分核酸酶嵌合的框架核酸探针， 其特征在于， 所述 MNAzyme组件上的催化域包括片段A和片段B， 其中， 片段A为连接链E， 片段B为DNA四面体底 部延伸出来的序列， 片段A和片段B的粘性末端彼此部分互补； 所述片段A由猝灭剂修饰， 所 述底物域由猝灭剂、 切割位点和荧光团组成， 片段A的猝灭剂和底物域上的荧光团可以发生 荧光共振能量转移。 3.根据权利要求2所述的一种 多组分核酸酶嵌合的框架核酸探针， 其特征在于， 所述片 段A和底物链的猝灭剂选自BHQ ‑2或DABCYL； 所述底物链的荧光团选自Cy3、 Cy5、 FAM、 ROX、 TAMRA或FIFC 。 4.根据权利要求1所述的一种多组分核酸酶 嵌合的框架核酸探针， 其特 征在于， 所述S1具有如SEQ  ID No.1所示的序列； 所述S2具有如SEQ  ID No.2所示的序列； 所述S3具有如SEQ  ID No.3所示的序列； 所述S4具有如SEQ  ID No.4所示的序列； 所述底物链Sub具有如SEQ  ID No.5所示的序列； 所述连接链E具有如SEQ  ID No.6所示的序列。 5.权利要求1 ‑4任一项所述的一种多组分核酸酶嵌合的框架核酸探针的制备方法， 其 特征在于， 将四条DNA四面体探针S1、 S2、 S3和S4， 以及底物链Sub和连接链E以等摩尔比混 合， 在90～100℃下持续5～15min后， 迅速降温至1～5℃并保持10～60s， 得到所述多组分核 酸酶嵌合的框架核酸探针， 并在1～10℃保存以备后续使用。 6.权利要求1 ‑4任一项所述的一种 多组分核酸酶嵌合的框架核酸探针在目标核酸检测 中的应用， 其特 征在于， 所述目标核酸包括各类DNA和RNA。 7.根据权利要求6所述的应用， 其特征在于， 当所述框架核酸探针与目标核酸共同孵育 时， 核酸酶组件的识别域特异 性识别相应的目标核酸， 在25～37℃下反应30～120 min， 可通 过荧光仪测定不同波长 激发下的荧 光强度。 8.权利要求1 ‑4任一项所述的一种 多组分核酸酶嵌合的框架核酸探针应用于检测生理 环境中的目标核酸分子， 其特 征在于， 所述 生理环境包括细胞、 血清、 唾液。 9.权利要求1 ‑4任一项所述的一种 多组分核酸酶嵌合的框架核酸探针在胞内目标核酸 成像和定位中的应用。 10.根据权利要求9所述的应用， 其特征在于， 将正常细胞和癌细胞分别以1 ×104～1× 106的细胞的密度接种于共聚焦培养皿中， 并在二氧化碳培养箱保持12～36h； 清洗3～5次 后， 加入终浓度为10～100nM的所述框架核酸探针， 孵育2～8 h后， 在扫描共聚焦显微镜下观权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114958973 A 2察细胞形态， 在不同波长下激发以获得对应的荧 光信号。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114958973 A 3