(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210624936.6 (22)申请日 2022.06.02 (71)申请人 重庆大学 地址 400044 重庆市沙坪坝区沙正 街174号 申请人 重庆大学附属三峡医院 (72)发明人 侯长军　鲁鹏　霍丹群　周仕英　 (74)专利代理 机构 重庆博凯知识产权代理有限 公司 50212 专利代理师 刘桢 (51)Int.Cl. C12Q 1/6827(2018.01) C12Q 1/6806(2018.01) C12Q 1/6886(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 15/113(2010.01)C12N 15/10(2006.01) (54)发明名称 一种基于重组酶聚合酶扩增与CRISPR/ Cas12a耦合的DNA甲基化检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种基于重组酶聚合酶扩增 与CRISPR/Cas12a耦 合的DNA甲基化检测方法， 利 用HhaI的特异性， 能够对甲基化和 非甲基化DNA 进行有效 区分， 同时， RPA结合Lambda酶的高扩增 能力可以产生大量的ssDNA， 然后获得的ssDNA可 以被Cas12a识别， 识别过程中不需要PA M位点， 并 且CRISPR/Cas12a的高特异性和自放大能力进一 步提高了传感性能， 从而使本发 明所述检测方法 具有较高的灵敏度和选择性， 良好的抗干扰能力 和重复性。 权利要求书2页 说明书10页 附图5页 CN 114990199 A 2022.09.02 CN 114990199 A 1.一种基于重组酶聚合酶扩增与CRISPR/Cas12a耦合的DNA甲基化检测方法， 其特征在 于， 包括如下步骤： （1） 转录合成crRNA： 将2  μL、 10 μM的T7启动子、 2  μL、 10 μM的crRNA模板和16  μL无酶 水配制成混合物， 放在95℃下退火5  min， 缓慢冷却至室温； 加入10  μL、 10 mM的核苷三磷酸 和1.5 μL的T7 RNA 聚合酶， 在37℃下转录反应16小时； 然后 在上述反应液中加入2  μL的脱 氧核糖核酸酶I， 37℃孵育2  小时， 对crRNA模板进行降解； 降解后， 用miRNA纯化试剂盒纯化 产物， 并对其进行定量， 得到 crRNA； （2） 对DNA靶基因和质粒进行甲基化处理： DNA靶基因和质粒都是双链， 将2  μL、 32 mM的 S‑腺苷甲硫氨酸、 5   µL的NEB生物缓冲液2、 2  μL、 100 U的CpG甲基转移酶， 100  nM DNA靶基 因或2 μg目标质粒和无酶水混合成50   µL反应液， 然后 在37℃孵育5  小时； 加入2  μL、 100 U 的CpG甲基转移酶和1  μL、 32 mM的S‑腺苷甲硫氨酸， 37℃继续孵育12  小时， 然后在65℃ 反 应20分钟后终止反应， 得到处理后的甲基化DNA或甲基化质粒， 将甲基化DNA作为电泳验证 靶标， 甲基化质粒作为检测的目标DNA； （3） 核酸内切酶裂解目标DNA： 将2 μL步骤 （2） 处理后的目标DNA、 1μL的NEB  限制性内切 酶缓冲液、 10  U的HhaI酶混合， 在37℃反应10~70分钟， 然后加热至65℃孵育25  分钟终止消 化， 得到消化产物； （4） RPA和单链DNA产物的生成： 用RPA试剂盒对步骤 （3） 的消化产物进行扩增， 得到双链 DNA扩增产物， 然后在Lambda核酸内切酶处 理下得到ssDNA； （5） CRISPR  / Cas12a检测： 将9  μL无酶水， 2  μL Cas12酶反应缓冲液，  2 μL、 1 μM的步 骤 （1） 得到的crRNA， 2  μL、 1 μM的Cas12a， 1  μL、 10 μM的荧光探针和4  μL步骤 （4） 得到的扩 增产物混合， 37℃孵育10~50分钟， 加入8 0 μL的双蒸 水后对得到的物质进行荧光检测分析， 得到目标DNA的检测结果。 2.根据权利要求1所述基于重组酶聚合酶扩增与CRISPR/Cas12a耦合的DNA甲基化检测 方法， 其特征在于， 在步骤 （4） 中， 扩增步骤为： 在RPA冻干粉中加 入29.5 μL的RPA反应缓冲 液， 制备得到RPA反应液； 然后取4  μL步骤 （3） 得到的消化产物， 向其中加入5.9  μL RPA反应 液， 0.5 μL、 10 μM的反向引物， 0.5  μL、 10 μM的正向引物和1  μL、 280 mM 醋酸镁， 在42℃条 件下反应15~35分钟， 得到反应产物； 然后将2  μL、 0.5 U/ μL~ 4 U/ μL的Lambda核酸内切酶 和2 μL的Lambda缓冲液加入反应产物中， 在37℃条件下反应20分钟， 得到产物s sDNA。 3.根据权利要求1所述基于重组酶聚合酶扩增与CRISPR/Cas12a耦合的DNA甲基化检测 方法， 其特征在于， 所述目标DNA 通过如下方法获得： 选取待测目标细胞， 将其放入培养基中 培养； 当待测目标细胞密度达到培养瓶的80%时， 提取基因组DNA， 并对其进行纯化， 得到目 标DNA。 4.根据权利要求1所述基于重组酶聚合酶扩增与CRISPR/Cas12a耦合的DNA甲基化检测 方法， 其特征在于， 在步骤 （5） 中， 所述荧光探针为HEX ‑DNA‑BHQ1荧光探针， 在490  nm激发下 用荧光光谱仪测定荧 光强度， 得到对目标DNA的检测结果。 5.根据权利要求1所述基于重组酶聚合酶扩增与CRISPR/Cas12a耦合的DNA甲基化检测 方法， 其特征在于， 当对目标DNA进行横向流动 分析的即时检测时， 在步骤 （5） 中， 所述荧光 探针为横向流动探针Bio ‑DNA‑FAM， 将横向流动试纸条插入步骤 （5） 得到的物质中2分钟后， 得到对目标DNA的检测结果。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114990199 A 26.根据权利要求1所述基于重组酶聚合酶扩增与CRISPR/Cas12a耦合的DNA甲基化检测 方法， 其特 征在于， 所述检测方法用于检测DNA甲基化的浓度。 7.根据权利要求6所述基于重组酶聚合酶扩增与CRISPR/Cas12a耦合的DNA甲基化检测 方法， 其特 征在于， 所述检测方法能够检测甲基化DNA的浓度为2  fM~20 pM。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114990199 A 3