(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210602449.X (22)申请日 2022.05.30 (71)申请人 华中农业大 学 地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山 街1号 申请人 岭南现代农业科 学与技术广东省实 验室 (72)发明人 陈翊平　魏巧玲　任亮琼　 (74)专利代理 机构 宜昌市三峡专利事务所 42103 专利代理师 王玉芳 (51)Int.Cl. C12Q 1/682(2018.01) C12Q 1/6834(2018.01) C12Q 1/6806(2018.01)C12Q 1/689(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/01(2006.01) C12R 1/42(2006.01) (54)发明名称 一种基于无酶级联信号放大检测食源性致 病菌的方法 (57)摘要 本发明公开了一种基于无酶级联信号放大 检测食源性致病菌的方法。 具体通过在磁珠和聚 苯乙烯微球上分别修饰与目标菌DNA互补的探针 1（Probe1）及DNA探针2（Probe2）和引发链 （tDNA） ， 通过碱基互补配对原则使目标菌DNA分 别与载体上的DNA探针进行分子杂交。 随后在该 体系中引入分别修饰了发卡1 （H1） 和发卡2 （H2） 的磁珠或PS微球， 在tDNA的触发下， 发卡能够高 效结合， 导致磁珠或微球载体状态发生显著改 变， 使得基于磁/电原理的生物传感器能够进行 灵敏响应。 本发明采用无酶辅助的信号放大方 式， 成本低、 稳定， 且克服了免疫反应中修饰抗体 后的微球或磁珠因抗体间固有的静电相互作用 引起自聚， 造成结果 假阳性的问题。 权利要求书3页 说明书12页 序列表1页 附图4页 CN 114990196 A 2022.09.02 CN 114990196 A 1.一种基于无酶级联信号放大检测食源性致病菌的方法， 其特征在于： 所述检测方法 包括以下步骤： 1） Probe1修饰磁珠MNP‑Probe1的制备； 2） tDNA‑PS‑Probe2/tDNA‑MNP‑Probe2的制备： Probe2及tDNA修饰聚苯乙烯 （PS） 微球或 磁珠 （MNP） ； 3） MNP‑H1、 MNP‑H2或PS‑H1、 PS‑H2的制备： H1和H2修饰PS微球或磁珠 （MNP） ； 4） 目标菌DNA的检测。 2.根据权利要求1所述的一种基于无酶级联信号放大检测食源性致病菌的方法， 其特 征在于： 所述DNA 链的序列为： Probe1具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列； Probe2具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列； tDNA具有SEQ  ID NO.3所示的核苷酸序列； H1具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列； H2具有SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。 3.根据权利要求1所述的一种基于无酶级联信号放大检测食源性致病菌的方法， 其特 征在于： 所述 步骤 （1） MNP ‑Probe1的制备过程为： （1‑1） 取磁珠置于离心管中， 用MEST缓冲溶液洗涤2 ‑3次， 磁分离弃去上清液， 得到洗涤 后的磁珠； （1‑2） 取质量浓度为 （1 ‑2） ： 1的EDC和NHS溶液于试管中并用MES溶液调节体积， EDC和 NHS溶液占最终溶液体积的1 ‑5%， 加入经步骤 （1） 洗涤后的磁珠， 随后放置室温下活化15 ‑ 30min， 得到氨基化的磁珠， 最后磁分离弃去上清液； （1‑3） 向氨基化的磁珠中加入Probe1并用Tris ‑EDTA缓冲液将其稀释5 ‑10倍， 其中 Probe1与氨基化的磁珠的质量比是1： （100 ‑200） ， 随后放置反应1.5 ‑2h得到MNP ‑Probe1； 用 TT 缓冲液将所得的MNP ‑Probe1洗涤3‑5次， 以TE缓冲液对MNP ‑Probe1进行重悬后， 于4℃保 存备用。 4.根据权利要求3所述的一种基于无酶级联信号放大检测食源性致病菌的方法， 其特 征在于： 所述步骤 （1） MNP ‑Probe1的制备过程为： 取1mg直径为1000nm的磁珠 （MNP1000） 于离心 管中， 用MES T缓冲溶液洗涤两次； 取50  μL的10 mg/mL EDC 和25 μL的10 mg/mL NHS溶液于 试管中并用MES溶液将 体积调至900 μL， 随后放置 室温下活化20min后洗涤2次得到氨基化的 磁珠； 向氨基化的磁珠的试管中加入5  μg的probe1并用Tris ‑EDTA缓冲液将溶液体积调至 500 μL， 随后放置室温下反应2h； 用1  mL TT缓冲液将所得的MNP1000‑Probe1洗涤三次， 每次 30 min； 最后用TE缓冲液对MNP1000‑Probe1进行重悬后， 于4℃进行保存以进一 步使用。 5.根据权利要求1所述的一种基于无酶级联信号放大检测食源性致病菌的方法， 其特 征在于， 步骤 （2） 中， tDNA ‑PS‑Probe2/tDNA‑MNP‑Probe2的制备过程为： （2‑1） 取PS微球或MNP于试 管中并用M EST缓冲液洗涤 2‑3次， 离心除去上清液； （2‑2） 向含有PS微球或MNP的试管中加入质量浓度比为 （1 ‑2） ： 1的EDC和NHS溶液并用 MES溶液调体积， EDC和NHS溶液占最终溶液体积的1 ‑5%， 随后放置室温下活化15 ‑30min， 得 到氨基化的P S微球或MNP； （2‑3） 向含有氨基化的PS微球或MNP的试管中加 入Probe2和tDNA， Probe2和tDNA与氨基权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 114990196 A 2PS微球或MNP的质量比为1： （100 ‑200） ， 并用TE缓冲液将其稀释5 ‑10倍， 随后放置室温下反 应1.5‑2h； 用TT 缓冲液将 所得的tDNA ‑PS‑Probe2或tDNA‑MNP‑Probe2洗涤3‑5次； 以TE缓冲 液对tDNA ‑PS‑Probe2或tDNA‑MNP‑Probe2进行重悬后， 于4℃保存备用。 6.根据权利要求5所述的一种基于无酶级联信号放大检测食源性致病菌的方法， 其特 征在于， 步骤 （2） 中， tDNA ‑PS‑Probe2/tDNA‑MNP‑Probe2的制备过程为： 取1  mg直径为3  μm的 PS微球或直径为3 0nm的MNP （MNP30） 于试管中并用M EST缓冲液洗涤两次； 取50 μL的10 mg/mL EDC和25 μL的10 mg/mL NHS溶液于试管 中并用MES溶液将体积调 至900 μL， 随后放置室温下活化20  min后洗涤2次； 取9  μgProbe2和7 μgtDNA于离心 管中， 并 用TE缓冲液将溶液体积调至500  μL， 放置室温下反应2  h； 用1mL TT缓冲液将所得的tDNA ‑ PS‑Probe2/tDNA‑MNP1000‑Probe2洗涤三次， 每次30  min； 最后用TE缓冲液对tDNA ‑PS‑ Probe2/tDNA‑MNP1000‑Probe2进行重悬后， 于4℃进行保存以进一 步使用。 7.根据权利要求1所述的一种基于无酶级联信号放大检测食源性致病菌的方法， 其特 征在于， 步骤 （3） 中， P S‑H1、 PS‑H2或MNP‑H1、 MNP‑H2的制备过程为： （3‑1） 使用前将H1和H2于95℃变性处 理， 随后在室温下保持1h使发卡结构形成； （3‑2） 取PS微球或MNP于试 管中并用M EST缓冲液洗涤， 随后离心弃去上清液； （3‑3） 向含有PS微球或MNP的试管中加入质量浓度比为 （1 ‑2） ： 1的EDC和NHS溶液， 并用 MES溶液调节体积， EDC和NHS溶液占最终溶液体积的1 ‑5%， 随后放置室温下活化15 ‑30min， 得到氨基化的P S微球或MNP； （3‑4） 将氨基化的PS微球或MNP溶液离心， 除去上清液， 向其中加入H1或H2， 并用TE缓冲 液稀释5‑10倍， 随后放置室温下反应1.5 ‑2h； （3‑5） 用TT 缓冲液将所得的PS ‑H1、 PS‑H2或MNP‑H1、 MNP‑H2洗涤3‑5次； 最后用TE缓冲液 对PS‑H1、 PS‑H2或MNP‑H1、 MNP‑H2进行重悬后， 于4℃保存备用。 8.根据权利要求7所述的一种基于无酶级联信号放大检测食源性致病菌的方法， 其特 征在于， 步骤 （3） 中， PS ‑H1、 PS‑H2或MNP‑H1、 MNP‑H2的制备过程为： 使用前将H1和H2于95℃下 变性处理5min， 随后在室温下保持1h使发卡结构形成； 取1  mg直径为3  μm的PS微球或直径 为30nm的MNP （MNP30） 于试管中并用MEST 缓冲液洗涤两次； 取50  μL的10 mg/mL EDC和25 μL 的10 mg/mL NHS溶液于试管中并用MES溶液将体积调至9 00 μL， 随后放置室温下活化20  min 后洗涤2次； 除去上清液后， 向离心管加入5  μg的H1或H2， 并用TE缓冲液将溶液体积调至500   μL， 随后放置室温下反应2  h； 用1 mL TT 缓冲液将 所得的PS ‑H1、 PS‑H2或MNP30‑H1、 MNP30‑H2 洗涤三次， 每次30  min； 最后用T E缓冲液对PS ‑H1、 PS‑H2或MNP30‑H1、 MN