(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210593956.1 (22)申请日 2022.05.27 (71)申请人 大连干细胞与精准医学创新研究院 地址 116000 辽宁省大连市高新园区信达 街57号产业园4 号楼 (72)发明人 刘晶　刘秀梅　王泽旭　王亮　 王小强　 (74)专利代理 机构 大连东方专利代理有限责任 公司 21212 专利代理师 周媛媛　李馨 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称 一种基于数字PCR技术检测耶氏肺孢子菌的 试剂盒及检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种基于数字PCR技术检测耶 氏肺孢子菌的试剂盒及检测方法， 属于病原微生 物检测技术领域。 本发明所述试剂盒包括特异性 扩增引物、 荧光探针、 阳性质控品、 阴性质控品和 检测试剂， 其中， 所述特异性扩增引物包括正向 引物和反向引物， 其核苷酸序列分别如SEQ  ID  NO.1～NO.2所示； 所述荧光探针的核苷酸序列如 SEQ ID NO.3所示， 所述阳性质控品为含有耶式 肺孢子菌基因保守区域的重组质粒， 保守区域的 核苷酸序列如SEQ  ID NO.4所示。 本发明所述试 剂盒和检测方法具有灵敏度高、 特异性强， 可对 复杂生物样本中低丰度的核苷酸进行定性和定 量检测的优点， 有助于实现临床肺孢子菌肺炎的 早期、 快速、 精确定量检测。 权利要求书1页 说明书7页 序列表2页 附图3页 CN 115029471 A 2022.09.09 CN 115029471 A 1.一种基于数字PCR技术检测耶氏肺孢子菌的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂 盒包括特 异性扩增引物和荧光探针， 其中， 所述特异性引物包括正向引物和反向引物， 正向引物的核 苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示， 反向引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示， 所述荧光探针 的核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示。 2.根据权利要求1所述的试剂盒， 其特征在于， 荧光探针类型为TaqMan探针或TaqMan ‑ MGB探针,荧光探针的5 ’端和3’端分别修饰有荧光基团和淬灭基团， 其中， 修饰5 ’端的荧光 基团选自： FAM,HEX,TET,JOE,VIC,ROX,Cy3或Cy5， 修饰3 ’端的淬灭基 团选自： TAMRA、 MGB、 Eclipse、 BHQ1、 BHQ2、 BHQ3或DABC YL。 3.根据权利要求1或2所述的试剂盒， 其特征在于， 所述的试剂 盒还包括阳性质控 品、 阴 性质控品以及无菌水。 4.根据权利要求3所述的试剂 盒， 其特征在于， 所述的阳性质控 品是含有耶式肺孢子菌 基因保守区域的重组质粒， 所述的重组质粒中载体骨架 为PUC57， 所述的耶式肺孢子菌基因 保守区域的核苷酸序列如SEQ  ID NO.4所示； 阴性质控品为TE缓冲液。 5.根据权利要求4所述的试剂盒， 其特征在于， 所述的阳性质控品的构建方法如下： 人 工合成耶式肺孢子菌基因保守区域的核苷 酸片段， 通过TA克隆连接到PUC57载体上， 进 行大 肠杆菌热转 化、 提取质粒， 测序验证核苷酸序列， 得到 重组质粒。 6.根据权利要求1所述的试剂盒， 其特征在于， 所述的基于数字PCR技术检测耶氏肺孢 子菌的试剂盒还 包括Taq酶、 dNTPs、 缓冲液。 7.一种基于数字PCR技术检测耶氏肺孢子菌的检测方法， 其特征在于， 主要包括如下步 骤： (1)对待检样品进行预处理， 然后使用核酸提取试剂盒提取DNA模板， 使用权利 要求1～ 6任一项所述的试剂盒配制包 含正向引物、 反向引物、 荧 光探针、 DNA模板的混合溶 液； (2)利用PCR微滴生成仪将步骤(1)制备的混合溶液生成微滴， 再利用微滴数字PCR仪进 行扩增， PCR反应结束后利用微 滴分析仪读取DNA拷贝数， 获得定性或定量结果。 8.根据权利要求7所述的检测方法， 其特征在于， 步骤(1)中所述样本包括痰液、 口咽拭 子、 肺泡灌洗液、 血 液、 组织提取液或排泄物。 9.根据权利要求7所述的检测方法， 其特征在于， 步骤(1)中所述混合溶液中正向引物 和反向引物的摩尔浓度均为10 0～1000nM， 荧光探针的摩尔浓度为5 0～500nmol/L。 10.根据权利要求7所述的检测方法， 其特征在于， 步骤(2)中所述的微滴数字PCR仪的 扩增程序为： 95～98℃预变性2～10分钟， 95～98℃变性30～60秒， 50～60℃退火并延伸30 ～60秒， 循环3 0～50次， 90～10 0℃微滴固化5～15分钟。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115029471 A 2一种基于数字PCR技术检测耶氏肺孢 子菌的试剂盒及检测 方法 技术领域 [0001]本发明属于病原微生物检测技术领域， 具体涉及一种基于数字PCR技术检测耶氏 肺孢子菌的引物和探针， 以及包 含该引物和探针的试剂盒及检测方法。 背景技术 [0002]肺孢子菌肺炎(Pneumocyst is pneumonia,P CP)是临床上常见的呼吸道系统疾病， 主要发生在免疫功能低下者， 如虚弱的早产儿、 获得性免疫缺陷综合征患者、 恶性肿瘤或血 液病患者化疗后以及长期使用免疫抑制药物的患者等免疫功能低下 的人群。 PCP是艾滋病 患者最重要的机会性 感染， 预期病死率为5％～30％， 是导致艾滋病患者死亡的重要因素之 一。 根据来源不同， 肺孢子菌分为5种： 人的耶氏肺孢子菌、 大鼠的卡式肺孢子菌、 小鼠源肺 孢子菌、 大鼠源肺孢子菌、 兔源肺孢子菌。 其中， 耶氏肺孢子菌(Pneumocystis  jirovecii, Pj)在环境中普遍存在， 可以引起人类呼吸系统感染， 是导致肺孢子菌肺炎的主要病原菌， 是免疫缺陷患者重要的条件致病病原体， 它们通常寄生在患者的肺泡中， 依赖肺部环境获 取营养物质， 具有 逃避宿主先天性免疫和适应性免疫的能力， 临床表现与体征不明显， 疾病 进展迅速， 造成患者肺 功能加速恶化， 病死率较高， 然 而早期诊断却非常困难。 [0003]目前临床上检测病原菌的常规方法包括： 1)呼吸道标本涂片染色镜检法； 2)体外 菌体培养鉴定 法； 3)组织病理学检测法； 4)血清学检测法； 5)PCR或qPCR检测法； 6)环介导等 温扩增(LAMP)法。 大量实验表明， 耶氏肺 泡子菌适应人体肺部生存环境， 可以在肺 泡细胞表 面生存， 却不能在常规的培养基上生长。 因此， 很难通过体外培养菌体后进行常规的检测分 析及药物筛选等。 而且在感染初期耶氏肺孢子菌含量很低， 又位于下呼吸道感染， 难于采样 及确诊， 容易延误病情 。 随着分子诊断技术的快速发展， 基于PCR技术的检测方法层出不穷， 例如实时定量PCR技术、 多位点序列分型技术、 限制性片段长度多态性分析技术、 环介导等 温扩增技术等。 尽管这些技术在临床病原菌检测中发挥了重要的作用， 然而却 不能有效的 从复杂样本中检测微量核酸拷贝数， 尤其是耶氏肺孢子菌的检测， 至今还是依赖传统的影 像学和病理学检测手段。 因此急需建立一种高效灵敏、 准确可靠的分子诊断方法， 为肺孢子 菌肺炎的早期诊疗提供 科学依据。 发明内容 [0004]鉴于此， 本发明建立了一种基于数字PCR技术检测耶氏肺孢子菌的试剂盒及检测 方法， 具有特异性好， 检测灵敏度高， 抗干扰能力强的特点， 突破了复杂生物样本中痕量耶 式肺孢子菌定性或定量检测的技 术瓶颈问题。 [0005]本发明目的是通过以下 方式实现： [0006]本发明提供一种基于数字PCR技术检测耶氏肺孢子菌的试剂盒， 所述试剂盒包括 特异性扩增引物和荧光探针， 其中， 所述特异 性引物包括正向引物和反向引物， 正向引物的 核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示， 反向引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示， 所述荧光探说　明　书 1/7 页 3 CN 115029471 A 3