(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210952527.9 (22)申请日 2022.08.09 (71)申请人 江苏格诺生物科技有限公司 地址 226009 江苏省南 通市开发区新 东路9 号 (72)发明人 杨义兵　何伟　薛良　韩云波　 (74)专利代理 机构 深圳博敖专利代理事务所 (普通合伙) 44884 专利代理师 杨洋 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6893(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/36(2006.01)C12R 1/35(2006.01) C12R 1/01(2006.01) C12R 1/90(2006.01) (54)发明名称 一种基于多重荧光PCR检测性传播病原 体的 引物探针组和试剂盒及其使用方法 (57)摘要 本发明公开一种基于多重荧光PCR检测性传 播病原体的引物探针组和试剂盒， 包括试剂盒和 引物探针组， 所述试剂盒包括有磁珠、 蛋白酶K、 裂解液、 结合液、 洗涤液和洗脱液， 所述引物探针 组包括有引物探针和位于引物探针两端的报告 荧光基团和一个淬灭荧光基团。 本发 明相对于目 前主流的以DNA为靶标的检测方法， 其灵敏度和 准确性更高， 并且可以检测包括尿液在内的各种 样本， 且不同部位的样本结果一致性很好， 并且 由于RNA只存在于活的细菌中， 所以RNA 检测结果 可以用于疗效判断， 同时实现七种病原体同时检 测， 降低检测成本， 可以辅助临床快速鉴别病原 体， 从而采取干预措施。 权利要求书2页 说明书7页 附图2页 CN 115074456 A 2022.09.20 CN 115074456 A 1.一种基于多重荧光PCR检测性传播病原体的引物探针组和试剂盒， 包括试剂盒和引 物探针组， 其特 征在于： 所述试剂盒包括有磁珠、 蛋白酶K、 裂解液、 结合液、 洗涤液和洗脱液； 所述引物探针组包括有引物探针和位于引物探针两端的报告荧光基团和一个淬灭荧 光基团。 2.根据权利要求1所述的基于多重荧光PCR检测性传播病原体的引物探针组和试剂盒 的使用方法， 其特征在于： 本方法包括以下步骤： S1、 模板制备； S2、 引物探针设计； S3、 荧光 检测和S4、 数据分析， 其中： S1、 模板制备： 利用所述试剂盒处 理提取样本； S2、 引物探针设计： 根据NCBI中各病原体16S  rRNA参考序列TV为18SrRNA， 按照引物探 针设计一般原则， 设计特异性引物探针； S3、 荧光检测： 荧光定量PCR通过荧光染料或荧光标记的具有特异性的探针， 对PCR产物 进行标记跟踪， 可以实时在线监控反应过程， 结合相应的软件 可以对产 物进行分析， 计算待 测样品模板的初始浓度； 多重荧光定量PCR在荧光定量PCR技术的基础上， 利用几种不同荧光基团的组合， 结合 仪器对不同通道荧光的检测能力实现对多个靶标的实时定量检测， 探针一端标记荧光基 团， 另一端 标记淬灭基团， 通过在不同序列末端标记不同荧光基团及相应的淬灭基团， 即可 形成不同的水解探针， 将上述探针及相应的扩增引物加至同一反应体系， 即可实现对多个 靶标的共同检测； 病原体分为两个反应 检测， 其中： 反应一检测CT、 NG和MG， 在反应一中加入内标用于监测反应提取和扩增整个过程； 反应二检测U U、 UP、 MH和TV； S4、 数据分析： 将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号， 荧光域值是PCR3 ‑ 15个循环荧光信号标准差的10倍， 荧 光域值设定在PCR扩增的指数期。 3.根据权利要求2所述的基于多重荧光PCR检测性传播病原体的引物探针组和试剂盒 的使用方法， 其特 征在于： 本方法步骤S1包括有如下步骤： a、 裂解结合： 取1.5ml离心管， 依次加入 1 μL内标， 5 μL蛋白酶K， 100 μL待提取样本， 100 μL 裂解液， 震荡混匀， 56℃孵育5分钟， 加入100μL结合液和5μL磁珠， 震荡混匀， 室温静置5分 钟； b、 清洗： 将步骤a室温静置5分钟的混合液置于磁力架上1分钟， 弃掉上清， 从磁力架上 取下， 加入200 μL洗涤液， 混匀后室温静置1分钟， 置于磁力架上1分钟， 弃掉上清， 重复洗一 遍， 然后在磁力架上晾干约5分钟； c、 洗脱： 将步骤b晾干的混合物从磁力架上取下， 加入50 μL去离子水， 混匀后 56℃放置5 分钟， 置于磁力架上1分钟， 转移上清到新的离心管， 提取完样本Qubit定量。 4.根据权利要求3所述的基于多重荧光PCR检测性传播病原体的引物探针组和试剂盒 的使用方法， 其特征在于： 本方法步骤c在混匀后56℃放置5 分钟的过程中需中间颠倒混匀， 防止磁珠沉降。 5.根据权利要求2所述的基于多重荧光PCR检测性传播病原体的引物探针组和试剂盒 的使用方法， 其特征在于： 本方法中包括有PCR反应液和引物探针液， 所述PCR反应液采用权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115074456 A 2Q225 HiScript III U+One Step qRT‑PCR Probe Kit试剂。 6.根据权利要求1所述的基于多重荧光PCR检测性传播病原体的引物探针组和试剂盒 的用方法， 其特征在于： 所述试剂盒引入了dUTP/UDG防污染系统， 热敏感UDG在室温下即可 将含U的污染物迅速降解； 55℃逆转录时， Heat ‑labile UDG迅速失活， 不会影响qRT ‑PCR的 效率和灵敏度， 整合HiScript  III Reverse Transcriptase以及热启动的Champagne  Taq  DNA Polymerase的优越性能， 配合经过优化 的缓冲体系， HiScript  IIIU+One  Step qRT‑ PCR Probe Kit的检测灵敏度可达到0.1pg总RNA或<10拷贝的RNA模板且具有更高的热稳定 性。 7.根据权利要求1所述的基于多重荧光PCR检测性传播病原体的引物探针组和试剂盒 的使用方法， 其特征在于： 所述裂解液主要成分为6M盐酸胍， 100mM  Tris‑HCl浓， pH值为 5.0‑6.7。 8.根据权利要求1所述的基于多重荧光PCR检测性传播病原体的引物探针组和试剂 盒， 其特征在于： 所述核 酸结合液为2 0％PEG8000、 3M  KI， 洗涤液为10％PEG8000、 0.5M  KI， 洗脱 液为去离 子水。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115074456 A 3