(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210648634.2 (22)申请日 2022.06.09 (71)申请人 杭州奥明 医学检验实验室有限公司 地址 310000 浙江省杭州市钱塘新区和享 科技中心 21幢309室 (72)发明人 童云广　任永丽　邓贵　 (51)Int.Cl. C12Q 1/6806(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12Q 1/6886(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种基于多重PCR靶向高通量测序检测肺癌 多基因突变的引物对、 试剂盒及方法 (57)摘要 本发明公开了一种基于多重PCR靶向高通量 测序检测肺癌多基因突变的引物对、 试剂盒及方 法。 本发明通过设计特定的肺癌多基因突变多重 PCR靶向高通量测序检测引物对， 结合PCR反应和 基因测序， 实现了对肺癌多基因突变的快速和低 成本检测， 检出率高达100%， 特异性为100%， 可以 用于临床检测肺癌多基因突变 。 权利要求书2页 说明书21页 序列表7页 附图1页 CN 114807310 A 2022.07.29 CN 114807310 A 1.一种基于多重PCR靶向高通量测序检测肺癌多基因突变的方法， 其特征在于： 所述检 测KRAS基因突变的靶向扩增上游/下游引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID 1/SEQ ID 2， SEQ  ID 3/ SEQ ID 4， SEQ ID 5/SEQ ID 6， SEQ ID 7/ SEQ ID 8， SEQ ID 9/SEQ ID 10， SEQ ID  11/SEQ ID 12， SEQ ID 13/SEQ ID 14， SEQ ID 15/SEQ ID 16和SEQ ID 17/SEQ ID 18所 示； 所述检测BRAF基因突变的靶向扩增上游/下游引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID 19/SEQ  ID 20， SEQ ID 21/ SEQ ID 22， SEQ ID 23/SEQ ID 24， SEQ ID 25/ SEQ ID 26， SEQ ID  27/SEQ ID 28和SEQ ID 29/SEQ ID 30所示； 所述检测PIK3CA 基因突变的靶向扩增上游/ 下 游引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID 31/SEQ ID 32和SEQ ID 33/ SEQ ID 34所示； 所述检测 EGFR基因突变的靶向扩增上游/下游引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID 35/SEQ ID 36所示； 以上所述引物对的5 ´端为通用引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID 37/SEQ ID 38所示。 2.一种基于多重PCR靶向高通量测序检测肺癌多基因突变的试剂 盒， 其特征在于， 包含 权利要求1所述的SEQ  ID 1‑SEQ ID 38的混合引物对、 靶向扩增缓冲液、 文库扩增缓冲液、 I5标签、 I7 标签、 纯化磁珠。 3.根据权利要求2所述的靶向扩增缓冲液， 其特征在于， 所述靶向扩增缓冲 液包括高保 真DNA聚合酶、 缓冲液、 dNTP混合物、 盐离 子。 4.根据权利要求2所述的文库扩增缓冲液， 其特征在于， 所述文库扩增缓冲 液包括高保 真DNA聚合酶、 PCR缓冲液、 dNTP混合物。 5.一种基于多重PCR靶向高通量测序检测肺癌多基因突变的方法， 其特征在于， 包括如 下步骤： 第一步， 提取人外周血、 细胞、 或新鲜组织基因组DNA； 第二步， 以提取的人外周血、 细胞、 或新鲜组织基因组DNA中的其中一种为模板， 加入权利要求1所述的SEQ  ID 1‑ SEQ  ID 38的混合引物对， 靶向扩增缓冲液和双蒸水， 进行扩增目标区域PCR反应； 第三步， 采用 磁珠对第二步中获得的PCR产物进行纯化， 得到扩增子液体； 第四步， 在第三步中获得的扩 增子液体中加入文库扩增缓冲液、 I5标签、 I7标签和双蒸水， 进行PCR反应使扩增子两侧带 上测序接头序列； 第五步， 采用磁珠对第四步中获得的PCR产 物进行纯化， 得到扩增子文库； 第六步， 对第五步所获得的扩增子文库进行测序和结果分析。 6.根据权利要求5所述的扩增目标区域PCR反应的步骤， 其特征在于， 所述扩增目标区 域PCR反应步骤中， 扩增目标区域的P CR反应体系为： 总体积 30微升， 包含15微升靶向扩增缓 冲液， 1‑400纳克基因组DNA， 2微升浓度为0.1 ‑0.5微摩尔每升的靶向扩增引物对混合物及 适量双蒸水。 7.根据权利要求5所述的扩增目标区域PCR反应的步骤， 其特征在于， 扩增目标区域的 PCR反应程序为： 热盖温度设定为105摄氏度； 首先95摄氏度预变性3分钟； 其次95摄氏度变 性20秒， 6 0摄氏度退火/延伸3 0秒， 15‑45个循环； 最后72摄氏度延伸5分钟。 8.根据权利要求5所述的磁珠对PCR产物进行纯化获得扩增子液体的方法， 其特征在 于， 所述磁珠对P CR产物进 行纯化获得扩增子液体的步骤为： 第一步， 向P CR产物内加入一定 体积磁珠， 充分混合均匀后， 室温孵育一定时间； 第二步， 将第一步所得到的混合物瞬离后 置于磁力架 一段时间， 待 液体澄清后小心弃去上清； 第三步， 往第二步所得到的混合物加入 一定体积  80%乙醇， 洗涤磁珠， 静置一段时间， 弃去乙醇 （重复该步骤一次） ； 第四步， 对第三 步所得到的混合物弃尽乙醇， 晾干至磁珠呈磨砂状； 第五步， 往第四步所获得的混合物加入 一定体积无核酸 酶纯水重悬磁珠， 室温静置一段时间后洗脱； 第六步， 将第五步所获得的混权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114807310 A 2合物瞬离后置 于磁力架上一段时间， 待液体澄清后将上清转移到新低吸附离心管中。 9.根据权利要求5所述的使扩增子两侧带上测序接头序列的PCR反应的步骤， 其特征在 于， 使扩增子两侧带上测序接头序列的PCR反应体系 为： 总体积30微升， 包含15微升文库扩 增缓冲液， 1微升浓度为45微摩尔每升的正向文库扩增引物I5， 1微升浓度为0.45微摩尔每 升的反向文库扩增引物I7， 13微升扩增子液体及适 量双蒸水。 10.根据权利要求5所述的使扩增子两侧带上测序接头序列的PCR反应的步骤， 其特征 在于， 使扩增子两侧带上测序接头序列的P CR反应程序为： 热盖温度设定为 105摄氏度； 95摄 氏度预变性3分钟； 95摄氏度变性20秒， 61摄氏度退火30秒， 72摄氏度延伸30秒， 循环数设定 为7； 72摄氏度终延伸5分钟。 11.根据权利要求5所述的磁珠对PCR产物进行纯化获得扩增子文库的方法， 其特征在 于， 所述磁珠对P CR产物进 行纯化获得扩增子文库的步骤为： 第一步， 向P CR产物内加入一定 体积磁珠充分混合均匀； 第二步， 往第一步所得到的混合物加入一定体积  80%乙醇， 漂洗两 次； 第三步， 对第二 步所得到的混合物用去离 子水进行洗脱， 将洗脱液转移到新的PCR管内。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114807310 A 3