(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210573937.2 (22)申请日 2022.05.25 (71)申请人 长春国科医工科技发展 有限公司 地址 130061 吉林省长 春市长春北湖科技 开发区盛北大街3333号北湖科技园产 业2-1期E12栋 (72)发明人 高玉舟　李海超　乔善鹏　刘珍妮　 (74)专利代理 机构 济南誉丰专利代理事务所 (普通合伙企业) 37240 专利代理师 尚久恒 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/84(2006.01) (54)发明名称 一种基于二重荧光定量PCR鉴定 毕赤酵母表 达体系中目的基因拷贝数的方法 (57)摘要 本发明公开了一种基于二重荧光定量PCR鉴 定毕赤酵母表达体系中目的基因拷贝数的方法， 广泛适用于以PAOX1为启动子的目的基因拷贝数 的鉴定。 该方法相较于传统qPCR测定目的基因拷 贝数的优点在于： 由于探针的存在， 测量准确度 和重复性远高于传统染料法qPCR。 相比于传统探 针法qPCR， D ‑qPCR会节约1倍的试剂成本， 且精密 度与重复性可与之相媲美。 在同一PCR管反应体 系下， 同时对PAOX1启动子基因和内参基因进行扩 增及荧光定量分析， 将筛选通量提高一倍， 避免 了分开扩增带来的加样误差， 同时节约了成本。 本专利提供一种通用D ‑qPCR体系， 包括引物、 探 针、 反应体系的成分以及测量方法， 用于高效、 快 速、 准确鉴定与筛 选目的基因的拷贝数。 权利要求书2页 说明书8页 序列表3页 附图3页 CN 115029469 A 2022.09.09 CN 115029469 A 1.针对PAOX1启动子基因和β ‑actin内参基因的二重荧光定量PCR体系在鉴定毕赤酵母表 达体系中目的基因拷贝数中的应用； 所述二重荧光定量PCR体系包括： 检测PAOX1启动子基因的上游引物Pf、 下游引物Pr和 Taqman探针PT， 其序列分别如SEQ  ID NO.1‑SEQ ID NO.3所示； 检测β‑actin内参基因的上游引物β f、 下游引物β r和Taqman探针β T， 其序列分别如SEQ   ID NO.4‑SEQ ID NO.6所示。 2.根据权利 要求1所述的应用， 其特征在于， 所述二重荧光定量PCR体系还包括： 10 ×Ex  Taq Buffer、 dNTP  Mixture、 TaKaRa  Ex Taq和ddH2O。 3.根据权利要求2所述的应用， 其特 征在于， 所述10 ×Ex Taq Buffer中含有20mM  Mg2+。 4.根据权利要 求1所述的应用， 其特征在于， 检测PAOX1启动子基因的上游引物Pf、 下游引 物Pr的终浓度均为120nM， Taqman探针PT的终浓度为240nM； 检测β ‑actin内参基因的上游引 物β f、 下游引物β r的终浓度均为120nM， Taqman探针β T的终浓度为240nM 。 5.根据权利要求1 ‑4任一项所述的应用， 其特征在于， 所述二重荧光定量PCR体系的体 积为25 μL， 包括： 10 ×Ex Taq Buffer 3.8 μL， dNTP  Mixture 2 μL， 上游引物Pf、 下游引物Pr、 上游引物β f、 下游引物β r各0.3 μL， Taqman探针PT、 Taqman探针β T各0.6 μL， TaK  aRa Ex Taq  0.2 μL， 基因 组模板5 μL， ddH2O 11.6 μL。 6.一种基于二重荧光定量PCR鉴定毕赤酵母表达体系中目的基因拷贝数的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)分别以毕赤酵母空白菌株基因组DNA和转化重组载体后的毕赤酵母基因组DNA为模 板， 构建针对PAOX1启动子基因和β ‑actin内参基因的二重荧光定量PCR体系进行D ‑qPCR分 析； (2)根据如下公式对毕赤酵母表达体系中目的基因拷贝数进行计算： 或利用以下估算公式： 其中， Copies(Mut+)为转化后Mut+型菌株中目的基因拷贝 数； Copies(Muts)为转化后Muts型 菌株中目的基因拷贝数； EX为PAOX1基因的扩增效率； ER为β‑actin内参基因的扩增效率； CqXcal 为以空白菌株基因组为模板进行D ‑qPCR后， PAOX1基因的Cq值； CqRcal为以空白菌株基因组为 模板进行D ‑qPCR后， 内参基因的Cq值； CqXtest为以转化后菌株基因组为模板进行D ‑qPCR后， PAOX1基因的Cq值； CqRtest为以转化后菌株 基因组为模板进行D ‑qPCR后， 内参基因的Cq值。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 步骤(1)中针对PAOX1启动子基因和β ‑actin 内参基因的二重荧光定量PCR体系为25 μL， 包括： 10 ×Ex Taq Buffer 3.8 μL， dNTP  Mixture  2 μL， 上游引物Pf、 下游引物Pr、 上游引物β f、 下游引物β r各0.3 μL， Taqman探针PT、 Taqman探权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115029469 A 2针β T各0.6 μL， TaKaRa  Ex Taq 0.2 μL， 基因 组模板5 μL， ddH2O 11.6 μL； 上游引物Pf、 下游引物Pr和Taqman探针PT， 其序列分别如SEQ  ID NO.1‑SEQ ID NO.3所 示； 上游引物β f、 下游引物β r和Taqman探针β T， 其序列分别如SEQ  ID NO.4‑SEQ ID NO.6所 示。 8.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 步骤(1)中， D ‑qPCR分析的反应条件为： 预 变性95℃180s； 变性95℃15s， 退火5 0℃30s， 延伸72℃15s， 循环3 0次。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115029469 A 3