(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210622311.6 (22)申请日 2022.06.02 (71)申请人 石家庄市农林科 学研究院 地址 050041 河北省石家庄市长安区胜利 北街479号 (72)发明人 张楠　李亚青　李孟军　史占良　 彭义峰　张士昌　何明琦　周广英　 (74)专利代理 机构 石家庄轻拓知识产权代理事 务所(普通 合伙) 13128 专利代理师 张培元 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种基于SNP标记的高直链淀粉硬粒小麦快 速辅助育种方法 (57)摘要 本发明公开了一种基于SNP标记的高直链淀 粉硬粒小麦快速辅助育种方法， 采用高特异性的 基于不等长引物等位特异性PCR的SNP标记， 在设 定的PCR反应体系和PCR扩增程序下， 基于琼脂糖 凝胶电泳染色条带区分鉴定突变位点和非突变 位点， 测定待测植株中一组或多组特定SNP位点 单核苷酸多态 性， 进行高直链淀粉硬粒小麦的快 速辅助育种。 本发明成功开发了高效进行高直链 淀粉硬粒小麦分子标记辅助育种的共显性的基 于不等长引物等位特异性PCR的SNP标记， 解决了 高直链淀粉硬粒小麦的快速 育种需求。 权利要求书2页 说明书6页 序列表2页 附图3页 CN 114921585 A 2022.08.19 CN 114921585 A 1.一种用于 高直链淀粉硬粒小麦快速辅助育种的试剂 盒， 通过检测待测植株中一组或 多组特定SNP位点单核苷酸多态 性， 进行高直链淀粉硬粒小麦的快速辅助育种； 所述试剂盒 包含序列表中SEQ ID NO.1、 SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3组成的引物对， 以及序列表中SEQ ID NO.4、 SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6组成的引物对， 以及序列表中SEQ ID NO.7、 SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9组成的引物对， 以及序列表中SEQ ID NO.10、 SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12组成的引物对。 2.一种共显性引物对， 用于高直链淀粉硬粒小麦的快速辅助育种， 包含序列表中SEQ ID NO.1、 SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3组成的引物对。 3.一种共显性引物对， 用于高直链淀粉硬粒小麦的快速辅助育种， 包含序列表中SEQ ID NO.4、 SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6组成的引物对。 4.一种共显性引物对， 用于高直链淀粉硬粒小麦的快速辅助育种， 包含序列表中SEQ ID NO.7、 SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9组成的引物对。 5.一种共显性引物对， 用于高直链淀粉硬粒小麦的快速辅助育种， 包含序列表中SEQ ID NO.10、 SEQ ID NO.1 1和SEQ ID NO.12组成的引物对。 6.权利要求1所述的试剂盒、 权利要求2或3或4或5所述的引物对的用途， 用于鉴定或辅 助鉴定硬粒小麦的直链淀粉 含量性状。 7.一种高直链淀粉硬粒小麦分子标记辅助育种方法， 其特征在于： 采用高特异性的基 于不等长引物等位特异性PCR 的SNP标记， 在设定的PCR 反应体系和PCR扩增程序下， 基于 琼脂糖凝胶电泳染色条带区分鉴定突变位点和非突变位点， 测定待测植株中一组或多组特 定SNP位点单核苷酸多态性， 进行高直链淀粉硬粒小麦的快速 辅助育种。 8.根据权利要求7所述的高直链淀粉硬粒小麦分子标记辅助育种方法， 其特征在于： 所 述PCR 反应 体系和PCR扩增程序包括： （1）SBEIIa‑A SNP位点： 2 ×Taq PCR StarMix 10 μL， 引物SEQ ID NO.1、 SEQ ID NO.2和 SEQ ID NO.3， 10 μmol/L， 各1 μL， 模板基因组DNA 1 μL （50 ‑100 ng） ， ddH2O 6 μL； 设定 PCR 扩增程序： 94℃ 预变性5 min； 94℃变性30 s， 55℃退火30 s， 72℃延伸20 s， 30个循 环； 72℃延伸5 mi n； PCR扩增产物采用3%琼脂糖凝胶电泳检测， 缓冲液为 1 ×TAE； （2）SBEIIa‑B SNP位点： 2 ×Taq PCR StarMix 10 μL， 引物SEQ ID NO.4、 SEQ ID NO.5和 SEQ ID NO.6， 10 μmol/L， 各1 μL， 模板基因组DNA 1 μL （50 ‑100 ng） ， ddH2O 6 μL； 设定 PCR 扩增程序： 94℃ 预变性5 min； 94℃变性30 s， 52℃退火30 s， 72℃延伸20 s， 30个循 环； 72℃延伸5 mi n； PCR扩增产物采用3%琼脂糖凝胶电泳检测， 缓冲液为 1 ×TAE； （3）SBEIIb‑A SNP位点： 2 ×Taq PCR StarMix 10 μL， 引物SEQ ID NO.7、 SEQ ID NO.8和 SEQ ID NO.9， 10 μmol/L， 各1 μL， 模板基因组DNA 1 μL （50 ‑100 ng） ， ddH2O 6 μL； 设定P CR 扩增程序： 94℃ 预变性5 min； 94℃变性30 s， 55℃退火30 s， 72℃延伸20 s， 30个循环； 72 ℃延伸5 mi n； PCR扩增产物采用3%琼脂糖凝胶电泳检测， 缓冲液为 1 ×TAE； （4）SBEIIb‑B SNP位点： 2 ×Taq PCR StarMix 10 μL， 引物SEQ ID NO.10、 SEQ ID NO.11 和SEQ ID NO.12， 10 μmol/L， 各1 μL， 模板基因组DNA 1 μL (50 ‑100 ng)， ddH2O 6 μL； 设 定PCR 扩增程序： 94℃ 预变性5 min； 94℃变性30 s， 50℃退火30 s， 72℃延伸20 s， 30个循 环； 72℃延伸5 mi n； PCR扩增产物采用3%琼脂糖凝胶电泳检测， 缓冲液为 1 ×TAE。 9.根据权利要求7所述的高直链淀粉硬粒小麦分子标记辅助育种方法， 其特征在于：权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114921585 A 2PCR扩增产物通过溴化乙锭染色鉴定四组共显性扩增条 带： （1）SBEIIa‑A SNP位点： 164 bp和143 bp； （2）SBEIIa‑B SNP位点： 180 bp和159 bp； （3）SBEIIb‑A SNP位点： 193 bp和172 bp； （4）SBEIIb‑B SNP位点： 250 bp和229 bp； 藉此高特异性的实现 SBEIIa和SBEIIb 4个SNP 位点突变纯合、 野生型纯合和位点杂合 的区分鉴定， 进行高直链淀粉硬粒小麦的快速分子标记辅助育种。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114921585 A 3