(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210609186.5 (22)申请日 2022.05.31 (71)申请人 广州市金圻睿生物科技有限责任公 司 地址 510000 广东省广州市黄埔区(国际生 物岛)螺旋四路9号第四层B401单元、 第五层B5 01单元、 第六层B6 01单元 (72)发明人 陈丹　李秋芳　朱鹏远　吴春求　 余成鹏　吴静　王杨　陈嘉昌　 柳俊　胡朝晖　 (74)专利代理 机构 北京品源专利代理有限公司 11332 专利代理师 王艳斋 (51)Int.Cl. C12Q 1/6869(2018.01)C12Q 1/689(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/445(2006.01) C12R 1/22(2006.01) C12R 1/385(2006.01) C12R 1/32(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种基于NGS平台的微生物定量方法及试剂 盒 (57)摘要 本发明公开了一种基于NGS平台的微生物定 量方法及试剂盒。 所述方法包括： 将针对目标微 生物的基因组上目标区域的引物和镜像序列与 待测样本混合， 进行文库制备及测序， 根据测序 结果计算目标微生物含量， 所述镜像序列包括引 物结合区和非引物结合区， 所述引物结合区的核 酸序列与所述目标微生物的基因组上目标区域 的引物结合区的核酸序列相同， 所述非引物结合 区与所述目标微生物的基因组上目标区域的非 引物结合区互补或为其反向核酸序列。 本发明针 对不同目标微生物的特异性序列， 设计相对应的 镜像序列， 共同进行建库及测序， 镜像序列可 以 作为靶标序列的理想对照， 等比换算得到准确的 目标微生物含量， 计算出目标微生物的真实含 量。 权利要求书2页 说明书15页 序列表4页 附图2页 CN 114891868 A 2022.08.12 CN 114891868 A 1.一种基于NGS平台的微 生物定量方法， 其特 征在于， 所述 微生物定量方法包括： 将针对目标微生物的基因组上目标区域的引物和镜像序列与待测样本混合， 进行文库 制备及测序， 根据测序结果计算目标微 生物含量； 所述镜像序列包括引物结合 区和非引物结合 区， 所述引物结合 区的核酸序列与所述目 标微生物的基因组上目标区域的引物结合区的核酸序列相同， 所述 非引物结合区与所述目 标微生物的基因 组上目标区域的非引物结合区互补或为 其反向核酸序列。 2.根据权利要求1所述的基于NGS平台的微生物定量方法， 其特征在于， 所述计算的公 式如式(1)所示； Cp＝(Ci×Rp×Vi)/Ri   式(1)； 其中， Cp为目标微生物的含量， Rp为目标微生物扩增到序列数， Ci为镜像序列的投入浓 度， Vi为投入镜像序列后与投入镜像序列前的体积比， Ri 为镜像序列扩增到序列数。 3.根据权利要求1或2所述的基于NGS平台的微生物定量方法， 其特征在于， 所述镜像序 列被插入到质粒中。 4.根据权利要求1 ‑3任一项所述的基于NGS平台的微生物定量方法， 其特征在于， 所述 方法还包括设计引物的步骤； 优选地， 所述设计引物包括： 获取目标微生物基因组序列， 筛选目标区域， 针对目标区 域设计引物。 5.根据权利要求1 ‑4任一项所述的基于NGS平台的微生物定量方法， 其特征在于， 所述 文库制备包括： 对目标微 生物的基因 组上目标区域及其镜像序列进行PCR扩增， 得到文库； 优选地， 所述PCR包括多重PCR。 6.根据权利要求1 ‑5任一项所述的基于NGS平台的微生物定量方法， 其特征在于， 所述 测序包括靶向测序。 7.根据权利要求1 ‑6任一项所述的基于NGS平台的微生物定量方法， 其特征在于， 所述 目标微生物包括鲍曼不动杆菌、 金黄色葡萄球菌、 肺炎克雷伯菌、 卡他莫拉菌、 铜 绿假单胞 菌或结核分枝杆菌中的任意 一种或至少两种的组合。 8.根据权利要求7所述的基于NGS平台微生物定量方法， 其特征在于， 所述鲍曼不动杆 菌的引物的核酸序列包括SEQ  ID NO.1和SEQ  ID NO.2所示的序列； 优选地， 所述鲍曼不动杆菌的镜像序列的核酸序列包括SEQ  ID NO.3所示的序列； 优选地， 所述金黄色葡萄球菌的引物的核酸序列包括SEQ  ID NO.4和SEQ  ID NO.5所示 的序列； 优选地， 所述金黄色葡萄球菌的镜像序列的核酸序列包括SEQ  ID NO.6所示的序列； 优选地， 所述肺炎克雷伯菌的引物的核酸序列包括SEQ  ID NO.7和SEQ  ID NO.8所示的 序列； 优选地， 所述肺炎克 雷伯菌的镜像序列的核酸序列包括SEQ  ID NO.9所示的序列； 优选地， 所述卡他莫拉菌的引物的核酸序列包括SEQ  ID NO.10和SEQ  ID NO.11所示的 序列； 优选地， 所述 卡他莫拉菌的镜像序列的核酸序列包括SEQ  ID NO.12所示的序列； 优选地， 所述铜绿假单胞菌的引物的核酸序列包括SEQ  ID NO.13和SEQ  ID NO.14所示 的序列；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114891868 A 2优选地， 所述铜绿假单 胞菌的镜像序列的核酸序列包括SEQ  ID NO.15所示的序列； 优选地， 所述结核分枝杆菌的引物的核酸序列包括SEQ  ID NO.16和SEQ  ID NO.17所示 的序列； 优选地， 所述结核分枝杆菌的镜像序列的核酸序列包括SEQ  ID NO.18所示的序列。 9.根据权利要求1 ‑8任一项所述的基于NGS平台的微生物定量方法， 其特征在于， 所述 微生物定量方法包括以下步骤： (1)获取目标微 生物基因 组序列， 筛 选目标区域， 针对目标区域设计引物； 设计镜像序列， 所述镜像序列包括引物结合区和非引物结合区， 所述引物结合区的核 酸序列与所述目标微生物的基因组上目标区域的引物结合区的核酸序列相同， 所述 非引物 结合区与所述目标微 生物的基因 组上目标区域的非引物结合区互补或为 其反向核酸序列； (2)将引物和镜像序列 与待测样本混合， 进行PCR扩增， 得到文库； (3)对文库进行测序， 根据测序结果按式(1)计算目标为 生物含量； Cp＝(Ci×Rp×Vi)/Ri   式(1)； 其中， Cp为目标微生物的含量， Rp为目标微生物扩增到序列数， Ci为镜像序列的投入浓 度， Vi为投入镜像序列后与投入镜像序列前的体积比， Ri 为镜像序列扩增到序列数。 10.一种微生物定量检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒应用于权利要求1 ‑9任一项 所述的基于NGS平台的微 生物定量方法中； 所述试剂盒包括针对目标微 生物的基因 组上目标区域的引物和镜像序列； 所述镜像序列包括引物结合 区和非引物结合 区， 所述引物结合 区的核酸序列与所述目 标微生物的基因组上目标区域的引物结合区的核酸序列相同， 所述 非引物结合区与所述目 标微生物的基因 组上目标区域的非引物结合区互补或为 其反向核酸序列； 优选地， 所述试剂盒还 包括PCR反应液。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114891868 A 3