(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210704034.3 (22)申请日 2022.06.21 (71)申请人 湖北省药品监 督检验研究院 地址 430075 湖北省武汉市东湖高新 技术 开发区高新大道6 66号 (72)发明人 汪波　胡敏　徐玲　王文斌　 李小芳　程华春　莫静　 (74)专利代理 机构 武汉智嘉联合知识产权代理 事务所(普通 合伙) 42231 专利代理师 徐绍新 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6853(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种基于MLPA技术对中药材麦冬与山麦冬 进行鉴别的方法 (57)摘要 本发明公开了一种基于多重连接探针扩增 技术对中药材麦冬与山麦冬进行鉴别的方法， 包 括以下步骤： 1)提取样品基因组DNA； 2)以基因组 DNA为模板， 利用特异性引物扩增麦冬与山麦冬 的叶绿体基因片段并纯化扩增产物； 3)将MLPA 探 针与纯化产物进行杂交； 4)利用DNA连接酶将杂 交产物进行连接； 5)利用通用引物对连接产物进 行qPCR扩增； 6)收集熔解曲线信号， 观测Tm值。 本 发明能够在很短的时间内同时鉴别中药材麦冬 和山麦冬， 该方法具有特异性强， 灵敏度高等优 点， 在中药 材真伪鉴定领域有很好的应用前 景。 权利要求书1页 说明书8页 序列表2页 附图5页 CN 115181811 A 2022.10.14 CN 115181811 A 1.一种基于多重连接探针扩增技术对中药材麦冬与山麦冬进行鉴别的方法， 其特征在 于包括以下步骤： 1)提取样品基因 组DNA； 2)以提取的基因组DNA为模板， 利用特异性引物扩增麦冬与山麦冬的叶绿体基因片段 并纯化扩增产物； 3)将MLPA探针与纯化产物进行杂交； 4)利用DNA连接酶将步骤3)的杂交产物进行 连接； 5)利用通用引物对步骤4)的连接产物进行qPCR扩增； 6)收集熔解曲线信号， 观测Tm值， 其中， 所述MLPA探针共3条， 由两条左探针和一条右探针组成， 探针序列如下： 麦冬左探针： 如SEQ  ID NO:1所示的序列； 山麦冬左探针： 如SEQ  ID NO:2所示的序列； 共同右探针： 如SEQ  ID NO:3所示的序列。 2.如权利要求1所述对中药材麦冬与山麦冬进行鉴别的方法， 其特征在于， 所述麦冬与 山麦冬的叶绿体 基因片段的核苷酸序列分别如SEQ  ID NO:8、 9所示。 3.如权利要求2所述对中药材麦冬与山麦冬进行鉴别的方法， 其特征在于， 用于扩增所 述叶绿体 基因片段的特异性引物序列如下； 上游引物:如SEQ  ID NO:4所示的序列； 下游引物:如SEQ  ID NO:5所示的序列。 4.如权利要求1所述对中药材麦冬与山麦冬进行鉴别的方法， 其特征在于， 所述通用引 物序列如下： Primer F:如SEQ ID NO:6所示的序列； Primer R:如SEQ ID NO:7所示的序列。 5.如权利要求1所述对中药材麦冬与山麦冬进行鉴别的方法， 其特征在于： 所述DNA连 接酶为9°N DNA Ligase。 6.如权利要求1所述对中药材麦冬与山麦冬进行鉴别的方法， 其特征在于： 所述MLPA探 针中， 麦冬左探针、 山麦冬左探针、 共同右探针的体积比为0.6： 1.0： 1.6 。 7.如权利要求1所述对中药材麦冬与山麦冬进行鉴别的方法， 其特征在于： 所述杂交的 温度是72℃。 8.如权利要求1所述对中药材麦冬与山麦冬进行鉴别的方法， 其特征在于： 所述qPCR扩 增的循环次数 是28次。 9.如权利要求1所述对中药材麦冬与山麦冬进行鉴别的方法， 其特征在于： 步骤6)中， 通过观测样 品熔解曲线峰和Tm值进行鉴定， 若样 品出现单一熔解曲线峰并且Tm值为78.98 ℃±0.1℃， 则为麦冬； 若样品出现单一熔解曲线峰且Tm值为80.57℃ ±0.1℃， 则为山麦冬； 若样品出现双熔解曲线峰并且 熔解峰Tm值为78.98℃ ±0.1℃和80.57℃ ±0.1℃， 则为麦冬 与山麦冬混合样品。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115181811 A 2一种基于MLPA技术对中药材麦冬与山麦冬进行鉴别的方 法 技术领域 本发明属于中药材鉴定领域， 具体涉及一种基于多重连接探针扩增(multiplex ligation ‑dependent  probe amplification,MLPA)技术对中药材麦冬与山麦冬进行鉴别 的方法。 背景技术 麦冬和山麦冬作为药用植物已有数千年的历史。 麦冬的主要来源是百合科沿阶草 属植物麦冬Ophiopogon  japonicus(L.f)Ker ‑Gawl.的干燥块根， 具有养阴生津， 润肺清心 的功效。 用于肺燥干咳， 阴虚痨嗽， 喉痹咽痛， 津伤口渴， 内热消渴， 心烦失眠， 肠燥便秘。 麦 冬是既可以用于预防和治疗， 又可用于保健食品范畴的中药， 是可药食两用及保健食品的 原材料之一。 目前， 市场上存在多种麦冬的混伪品， 这些混伪品主要来源于沿阶草属和山麦冬 属 Liriope植物， 其中最常见的为山麦冬和阔叶山麦冬。 山麦冬来源为百合科山麦冬属植 物湖北麦冬Liriope  spicata(Thu nb.)Lour.var.prolifera  Y.T.Ma或短葶山麦冬Liriope   mus cari(Decne.)Baily的干燥块根。 两者均被收录于 《中国药典》 (2020年版)， 药典 并未将 二者合并， 两者性 味相同， 性状相 似， 功能与主治相同， 易被混用。 在市场上， 多数商品并未 将麦冬和山麦冬进 行严格区分， 而 是将山麦冬作为麦冬的代用品， 并一律称为麦冬， 且对品 种不加注明。 由于山麦冬和麦冬的功效并非完全一致且价格不同， 二者混用不但会影响药 效还会造成经济损失。 序列比对筛查发现， 在叶绿体基因片段序列中， 山麦冬属与沿阶草属间存在3个稳 定的变异位点， 即A/G、 A/T、 C/T。 由此可得， 这3个差异位点可作为两属间的鉴别 位点。 同时 表明， 该基因片段序列可作为山麦冬属与沿阶草属的属间鉴别标记。 基于此， 本发明利用 MLPA技术结合熔解曲线， 针对变异位点设计了特异性探针进行扩增， 并由熔解曲线形成的 熔解曲线峰得到熔解温度， 根据Tm值的差异来鉴别麦冬与山麦冬， 并进行特异性、 灵敏度、 掺伪比实验。 本发明构建了麦冬类药材基原物种系统鉴定体系， 用分子生物学技术针对麦 冬和山麦冬药材相互掺杂问题建立快速检测鉴别方法， 为麦冬类药材正本清源和临床用药 安全提供技 术支撑。 发明内容 本发明采用MLPA方法， 针对中药材麦冬和山麦冬的叶绿体基因片段序列设计探 针， 从而建立 一种可同时鉴别麦冬、 山麦冬药 材的方法。 一种基于多重连接探针扩增技术对中药材麦冬与山麦冬进行鉴别的方法， 它包括 以下步骤： 1)提取样品基因 组DNA； 2)以提取的基因组DNA为模板， 利用特异性引物扩增麦冬与山麦冬的叶绿体基因 片段并纯化扩增产物；说　明　书 1/8 页 3 CN 115181811 A 3