(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210689364.X (22)申请日 2022.06.17 (71)申请人 华南农业大 学 地址 510610 广东省广州市天河区五山 华 南农业大 学 (72)发明人 聂庆华　李卓航　郑茗　 (74)专利代理 机构 北京东方盛凡知识产权代理 事务所(普通 合伙) 11562 专利代理师 林佳纯 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种基于KASP技术的丝羽乌骨鸡玫瑰冠分 子标记及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种基于KASP技术的丝羽乌 骨鸡玫瑰冠分子标记及其应用， 属于动物遗传育 种技术及分子生物学领域。 该分子标记的核苷酸 序列如SEQ  ID NO： 1所示， 在SEQ  ID NO： 1所示序 列第201bp处有 一个G/T碱基突变。 本发明发现鸡 基因组7号染色体第21948753位发生 G向T的点突 变， 对该SNP位点设计引物， 获得的引物组可有效 区分等位变异位点， 并且通过DNA提取、 PCR特异 性扩增、 KASP基因分型检测即可完成对丝羽乌骨 鸡玫瑰冠的鉴定， 利用本发明分子标记可筛选杂 合玫瑰冠基因型， 对丝羽乌骨鸡玫瑰冠辅助选择 育种具有重要价 值。 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图1页 CN 114854880 A 2022.08.05 CN 114854880 A 1.一种与丝羽乌骨鸡玫瑰冠相关的分子标记， 其特征在于， 其核苷酸序列如SEQ  ID  NO： 1所示。 2.根据权利要求1所述的分子标记， 其特征在于， SEQ  ID NO： 1所示序列第201bp处有一 个G/T碱基突变。 3.一种检测权利要求1 ‑2任一项所述的分子标记的KASP引物组， 其特征在于， 包括核苷 酸序列如SEQ  ID NO:2所示的第一正向引物、 核苷酸序列如SEQ  ID NO:3所示的第二正向引 物和核苷酸序列如SEQ  ID NO:4所示的反向引物。 4.根据权利要求3所述的KASP引物 组， 其特征在于， 所述第一正向引物和所述第二正向 引物5’端连接不同颜色的荧 光基团； 所述第一 正向引物连接 HEX荧光基团， 所述第二 正向引物连接FAM荧 光基团。 5.一种基于KASP技术检测丝羽乌骨鸡玫瑰冠基因分型的试剂盒， 其特征在于， 包括权 利要求3‑4任一项所述的KAS P引物组。 6.一种鉴定 丝羽乌骨鸡玫瑰 冠基因型的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)提取待测丝羽乌骨鸡的基因 组DNA； (2)利用权利要求 4所述KAS P引物组进行PCR扩增， 获取扩增产物； (3)根据扩增产物的荧 光信号鉴定待测丝羽乌骨鸡的玫瑰 冠基因型； 若荧光信号为HEX， 则鉴定待测丝羽乌骨鸡的玫瑰冠基因型为RR； 若为FAM和HEX， 则鉴 定为Rr， 若为FAM， 则鉴定为r r。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 所述PCR扩增的反应体系包括： 模板DNA  2 μ L， 引物混合液 KASP Assay mix 0.14 μL， 2 ×2×KASP Master mix 5 μL， ddH2O 2.86 μL。 8.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述引物混合液KASP  Assay mix中第一正 向引物、 第二 正向引物和反向引物的体积比为1： 1： 2。 9.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 所述PCR扩增的反应程序为： 预变性94℃   15min； 变性94℃  20s， Touch‑down退火并延伸61℃～ 55℃ 60s， 10个循环， 每个循环退火及 延伸的温度降低0.6℃； 变性94℃  20s， 退火并延伸5 5℃ 60s， 26个循环。 10.一种权利要求权利要求1 ‑2任一项所述的分子标记、 权利要求3 ‑4任一项所述的 KASP引物组或权利要求5所述的试剂盒在鉴定 丝羽乌骨鸡玫瑰 冠基因型中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114854880 A 2一种基于KASP技术的丝羽乌骨鸡玫瑰冠分子标记及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及动 物遗传育种技术及分子生物学领域， 特别是涉及一种基于KASP 技术 的丝羽乌骨鸡玫瑰 冠分子标记及其应用。 背景技术 [0002]鸡冠外观的选择在家禽育种工作中是一项重要的任务， 同时也是用于论证孟德尔 遗传定律的经典案例。 雌性鸡在择偶时相较于其他的装饰性状， 主要看雄性的鸡冠， 它们更 偏向于具有较大颜色较深鸡冠的雄 性鸡。 [0003]丝羽乌骨鸡外貌与其他鸡种有明显的不同， 标准的丝羽乌骨鸡具有暗紫色的玫瑰 冠、 冠后生有绒球状的丝羽、 耳叶现出蓝绿色彩、 肉垂减小并生有胡 须、 胫部生胫羽、 乌皮乌 肉乌骨等十余个特点。 故玫瑰冠不仅作为三种特殊冠型(豆冠、 玫瑰冠和双冠)之一， 更是丝 羽乌骨鸡的标志性外观性状之一。 但玫瑰冠为常染色体显性遗传， 如何选择高效的方法剔 除具有单 冠等位基因的杂合子， 是保证其 玫瑰冠稳定遗传的重要问题。 [0004]KASP(竞争性等位基因特异性PCR  Kompetit ive Allele Specific  PCR)技术是一 种基于荧光信号的竞争性等位基因特异 性PCR， 是针对模板样品中的SNP(单核苷 酸多态性， Single Nucleotide  Polymorphisms)位点进行检测分型， 可以够精确地进行双等位基因分 型。 其相较于传统的PCR具有通量高、 成本低、 效率高、 准确度高、 遗传稳定性好等优点。 因此 基于KASP技术鉴定丝羽乌 骨鸡玫瑰冠的分子标记， 用于筛选杂合玫瑰冠基因型， 对丝羽乌 骨鸡玫瑰 冠辅助选择育种具有重要价 值。 发明内容 [0005]本发明的目的是提供一种基于KASP技术的丝羽乌骨鸡玫瑰冠分子标记及其应用， 以解决上述现有技术存在的问题， 通过该分子标记可开展对丝羽乌骨鸡玫瑰冠 的鉴定， 筛 选杂合玫瑰冠基因型， 对丝羽乌骨鸡玫瑰 冠辅助选择育种具有重要价 值。 [0006]为实现上述目的， 本发明提供了如下 方案： [0007]本发明提供一种与丝羽乌骨鸡玫瑰冠相关的分子标记， 其核苷酸序列如SEQ  ID  NO： 1所示。 [0008]进一步地， SEQ ID NO： 1所示序列第201bp处有一个G/T碱基突变。 [0009]本发明还提供一种检测上述的分子标记的KASP引物组， 包括核苷酸序列如SEQ  ID  NO:2所示的第一正向引物、 核苷酸序列如SEQ  ID NO:3所示的第二正向引物和 核苷酸序列 如SEQ ID NO:4所示的反向引物。 [0010]进一步地， 所述第一正向引物和所述第二正向引物5 ’端连接不同颜色的荧光基 团； [0011]所述第一 正向引物连接 HEX荧光基团， 所述第二 正向引物连接FAM荧 光基团。 [0012]本发明还提供一种基于KASP 技术检测丝羽乌骨鸡玫瑰冠基因分型的试剂盒， 包括 上述的KAS P引物组。说　明　书 1/6 页 3 CN 114854880 A 3