(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210636366.2 (22)申请日 2022.06.07 (71)申请人 中国人民解 放军陆军 军医大学第一 附属医院 地址 400038 重庆市沙坪坝区高滩岩正 街 30号 (72)发明人 阳莎　余恋雨　陈鸣　唱凯　 詹新宇　罗洁　陈志国　王彬潘　 赵爽　汤晓琦　 (74)专利代理 机构 北京高沃 律师事务所 1 1569 专利代理师 黄明光 (51)Int.Cl. C12Q 1/6825(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种基于DNAzyme变构调节 的DNA四面体样 纳米机器、 miRNA检测方法及应用 (57)摘要 本发明提供了一种基于DNA zyme变构调节的 DNA四面体样纳米机器、 miRNA检测方法及应用， 涉及miRNA检测技术领域技术领域。 本发明提供 了一种基于DNAzyme变构调节的DNA四面体样纳 米机器， 所述纳米机器由寡核苷酸链P1 ‑P5和一 条抑制剂链组成。 本发明所述的DNA四面体样纳 米机器使DNAzyme和底物在空间上更加接近， 并 在一定程度上包裹DNA zyme， 可显著增强DNA zyme 的灵敏度、 细胞渗透能力和抗酶降解能力。 权利要求书1页 说明书9页 序列表3页 附图3页 CN 114934099 A 2022.08.23 CN 114934099 A 1.一种基于DNAzyme变构调节的DNA四面体样纳米机器， 其特征在于， 所述纳米机器由 寡核苷酸链P1‑P5和一条抑制剂链组成， 所述寡核苷 酸链P5与抑制剂链互补， 所述抑制剂链 含有DNA识别序列， 所述DNA 识别序列能够与待测miRNA结合。 2.根据权利要求1所述的DNA四面体样纳米机器， 其特征在于， 所述寡核苷酸链P1、 P2、 P4、 P3部分序列、 P5部分序列构成所述DNA四面体的主框架； 所述P5链的中间部分为E6型 DNAzyme。 3.根据权利要求1所述的DNA四面体样纳米机器， 其特征在于， 所述寡核苷酸链P1、 P2、 P4构成所述DNA四面体的框架P124， 所述寡核苷酸链P5和抑制剂链构成锁定的变构DNAzyme   P5I； 所述抑制剂链的5'和3'末端分别设计两个脚趾区域。 4.根据权利要求1或2所述的DNA四面体样纳米机器， 其特征在于， 所述P3链的5'端第10 位碱基为 RNA修饰的底物， 所述第10位碱基为核糖核苷 酸； 所述P3链中的第24位碱基可以替 换为淬灭基团。 5.根据权利 要求1所述的DNA四面体样纳米机器， 其特征在于， 所述寡核苷酸链P1 ‑P5的 序列如SEQ  ID NO.1‑5所示， 所述抑制剂链的序列选自SEQ  ID NO.6‑9所示序列中的一种。 6.权利要求1 ‑5任意一项所述DNA四面体样纳米机器的制备方法， 其特征在于， 所述方 法包括如下步骤： 将寡核苷酸链P1、 P2、 P4与缓冲液混合， 经第一反应得到DNA四面体 的框架P124； 寡核苷 酸链P5、 抑制剂链与缓冲液混合， 经第二反应得到锁定的变构 DNAzyme P5I； 将P124、 P5I、 P3与缓冲液混合， 经第三反应即得 所述的DNA四面体样纳米机器。 7.根据权利要求6所述的制备方法， 其特征在于， 所述缓冲液的组成为： 10mM  HEPES、 100mM NaCl和50mM MgCl2， pH 6.0。 8.一种miRNA的检测方法， 其特 征在于， 所述方法包括如下步骤： 将权利要求1或5任意一项所述的DNA四面体样纳米机器与靶miRNA混合孵育， 所得产物 经凝胶电泳以及荧 光检测即可检测靶miRNA。 9.根据权利 要求8所述的检测方法， 其特征在于， 所述孵育的温度为20 ‑40℃， 所述孵育 的时间为0.5 ‑10h。 10.权利要求1 ‑5任意一项所述的DNA四面体样纳米机器或权利要求8 ‑9任意一项所述 的检测方法在miRNA检测或调节中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114934099 A 2一种基于DNAzyme变构调节的DNA四 面体样纳米机 器、 miRNA检 测方法及应用 技术领域 [0001]本发明涉及miRNA检测技术领域， 具体涉及一种基于DNAzyme  变构调节的DNA四面 体样纳米机器、 miRNA检测方法及应用。 背景技术 [0002]MicroRNAs(miRNAs)通过在转录后水平调控mRNA， 进而调控下游蛋白质的变化， 在 细胞增殖、 发育和成熟等方面发挥关键作用，  miRNAs也因此成为新治疗方法的最有吸引力 的工具和靶点之一。 另一方面， miRNAs的异常表达与许多人类疾病如实体瘤、 骨髓瘤和B  细 胞淋巴瘤等密切相关。 因此， miRNA也被认为是早期癌症诊断和预后的重要肿瘤生物标志 物。 与无细胞miRNA相比， 细胞内miRNA  在高浓度和稳定性方面表现出显著的优势， 而且原 位检测细胞内的  miRNA可以避免不同RNA 提取方法的效率限制。 因此， 建立一种高灵敏度和 特异性的集成纳米机器同时实现细胞内miRNA检测和负反馈浓度调节， 有利于提高肿瘤的 早期诊断和治疗效率。 [0003]DNA不仅是遗传信息的载体， 也是D NA纳米结构的分子构建模块。 D NA可以自我折叠 成复杂的三级结构， 形成具有特定识别和催化能力的功能性核酸， 如适配体、 DNAzymes、 i ‑ 基序以及G四联体等。 这些功能性核酸在生物分子检测、 成像和药物传递方面已显示出极大 的潜力。 其中， DNAz ymes是一种具有催 化功能的单链核酸， 同时具有DNA和酶的双重作用， 与 蛋白酶相比， 结构更稳定， 也更易于合成和编程。 通过DNA链置换， 可以在不改变DNAzyme序 列的基础上， 实现DNAzyme的变构， 调节 其活性。 为了实现对miRNA  的同时检测和调控， 可以 引入一条miRNA抑制链来介导DNAzyme  的活性。 简而言之， DNAzyme的活性取决于其构象改 变， 而其构象受到miRNA抑制剂的调控。 miRNA抑制剂和靶标的结合可以触发从锁定的 DNAzyme结构到活化的DNAzyme的构象变化。 后者能够切割底物并释放荧光用于细胞内 miRNA传感。 与此同时， miRNA抑制剂能竞争性抑制miRNA与下游基因的相互作用， 从而调节 靶细胞的功能。 因此， 这种miRNA抑制剂控制的变构DNAzyme可用于miRNA  传感和靶细胞的 同步调节。 然 而， DNAzyme的细胞渗透性 不足， 需要选择合 适的递送系统。 [0004]目前， 转运D NAzyme及其底物到细胞内主要依赖于转染试剂和无机纳米材料。 然而 这些添加的成分具有生物相容性风险， 并会使  DNAzyme的制备更加复杂。 DNA四面体作为 DNA折纸技术的典型代表， 因其具有结构稳定、 生物相容性好、 易于灵活编程等优点， 广泛应 用于靶向给药、 光热治疗、 体内成像等领域。 例如， DNA四面体可作为纳米载体用来递送 siRNA以沉默靶基因， 或传递亚甲蓝用于体内光动力治疗。 然而， 如何利用 DNA四面体转运 DNAzyme仍旧是一个亟 待解决的问题。 发明内容 [0005]有鉴于此， 本 发明的目的在 于提供一种基于DNAzyme变构调节的D NA四面体样纳米 机器， 可用于微 量miRNA的传感及浓度调节， 具有良好的灵敏度和特异性。说　明　书 1/9 页 3 CN 114934099 A 3