(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210778136.X (22)申请日 2022.06.28 (71)申请人 华南农业大 学 地址 510642 广东省广州市天河区五山路 483号 (72)发明人 曾振灵　郝杰　谢龙飞　熊文广　 曾东平　刘雅红　 (74)专利代理 机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 专利代理师 段卉 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种基于CRISPR-Cas12a可视化检测多杀性 巴氏杆菌的试剂盒及应用 (57)摘要 本发明公开了一种基于CRISPR ‑Cas12a可视 化检测多杀性巴氏杆菌的试剂盒及方法， 所述试 剂盒通过先对待测样品进行扩增， 接着在crRNA 引导序列的介导下， 引导CRISPR ‑Cas12a体系对 RPA扩增产物进行识别结合并切割目标双链DNA 激活非特异性核酸酶功能， 然后任意切割体系中 的ssDNA荧光探针得到切割产物并进行显色检测 判断。 本发 明所述的试剂盒针对多杀性巴氏杆菌 核酸的检测灵敏度可达2 拷贝/μL， 且可选用RPA 进行扩增， 全程在37℃环境下进行， 裸眼可直接 观察， 实现了脱离实验室大型仪器的依赖、 实现 现场快速可视化检测靶标核酸的目的。 权利要求书1页 说明书13页 序列表2页 附图10页 CN 115029459 A 2022.09.09 CN 115029459 A 1.一种组合物， 其特征在于， 所述组合物包含crRNA引导序列和ssDNA荧光探针； 所述 crRNA引导序列的核苷酸序列为如SEQ  ID NO： 1、 SEQ ID NO： 2或SEQ  ID NO： 3所示。 2.根据权利 要求1所述的组合物， 其特征在于， 所述crRNA引导序列的核苷酸序列如SEQ   ID NO： 2所示。 3.根据权利要求1所述的组合物， 其特 征在于， 所述组合物还 包含扩增引物对。 4.根据权利 要求3所述的组合物， 其特征在于， 所述扩增引物对为PCR引物对或RPA引物 对。 5.根据权利 要求4所述的组合物， 其特征在于， 所述RPA引物对的上游引物P m‑RPA2‑F的 核苷酸序列如SEQ  ID NO： 4所示， 下游引物Pm ‑RPA2‑R的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 5所示。 6.根据权利要求4所述的组合物， 其特征在于， 所述PCR引物对的上游引物PCR ‑Kmt1‑ PM‑F的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 6所示， 下游引 物PCR‑Kmt1‑PM‑R的核苷酸序列如SEQ  ID  NO： 7所示。 7.根据权利 要求1所述的组合物， 其特征在于， 所述ssDNA荧光探针的核苷酸序列如SEQ   ID NO： 8所示。 8.根据权利要求7所述的组合物， 其特征在于， 所述ssDNA荧光探针的5 ’端标记荧光基 团， 3’端标记淬灭基团。 9.根据权利要求8所述的组合物， 其特征在于， 所述荧光基团为ROX， 所述淬灭基团为 BHQ2。 10.一种检测多杀性巴氏杆菌的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒包含权利要求1～9任 一所述的组合物。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115029459 A 2一种基于CRI SPR‑Cas12a可视化检测多杀性巴氏杆菌的试剂 盒及应用 技术领域 [0001]本发明涉及细菌分子诊断技术领域， 具体地， 涉及一种基于CRISPR ‑Cas12a可视化 检测多杀性巴氏杆菌的试剂盒及应用。 背景技术 [0002]多杀性巴氏杆菌(Pasteurella  mutocida,Pm)是一类能引起多种动物及人感染， 并严重发病的重要人畜共患病原菌。 一旦机体感染Pm后， 常出现急性、 出血性或败血性症 状， 如猪肺疫、 牛、 羊、 兔的出血性败血症、 禽霍乱 等一系列严重的传染病。 传统上， Pm以其荚 膜抗原分型法可分为A、 B、 D、 E和F这5种血清型(10.100 7/82_2012_216)。 每个血清型的宿主 嗜性、 致病特点都不尽相同。 已证实， 人可通过猫狗抓伤和咬伤感染Pm(10.1056/ NEJM199901143400202)。 另外， Pm也能引起人类的其他疾病和 感染， 如： 泌尿道感染、 脑膜 炎、 败血症， 甚至死亡。 该病发生与流行直接危害养殖业的健康发展和公共卫生的安全。 目 前， 临床上对Pm的检测主要对病原菌进行分离培养、 生化鉴定、 涂片染色镜检等， 这些方法 检验周期长， 步骤繁琐， 耗时费力， 主观性强， 易出现漏检、 误检等因素， 不适合临床快速检 测的需要。 近年来PCR、 荧光定量PCR相继被广泛应用多 杀性巴氏杆菌的诊断中， 但都由于对 操作人员有一定技术要求， 需要复杂仪器和较高检测环境， 耗时长， 在基层条件差和技术人 员匮乏的情况 下， 难以满足现场实地的快速检测。 [0003]CRISPR‑Cas技术是近年来备受欢迎的基因编辑技术， 该技术为生物工程、 医学领 域、 核酸检测等领域带来极大改变。 最近的研究进展表明， CRISPR相关(Cas)内切核酸 酶， 如 Cas12a、 Cas13a和Cas14a， 均具有可用于核酸检测特征， 如人乳头瘤病毒(HPV)、 塞卡病毒 (ZIKV)、 登革热病毒(DENV)(10.1126/science.aam932 1)。 而CRISPR ‑Cas12a技术经常被用 作识别切割DNA片段的理想手段， 当Cas12a识别靶标DNA后， Cas12a/crRNA/DNA形成三元复 合物被激活， Cas12a在特异性切割靶标序列的同时， 可以非特异性切割体系中任意的单链 DNA(ssDNA)(10.1126/science.aar6245)。 目前该方法主要依靠检测荧光信号来判定检测 样品中靶标基因的存在， 检测时依然需借助相关仪器设备。 因此， 迫切需要开发一种快速、 高灵敏性、 高特异性、 裸眼可视化的且适用于现场快速检测多杀性巴氏杆菌的方法。 [0004]重组酶聚合酶等温扩增技术(RPA)是由英国TwistDx  Inc公司于2006年研发的一 种新型体外核酸恒温扩增技术， 它 不仅可以检测DNA还适合检测RNA， 整个反应主要依靠三 种酶： 聚合酶、 重组酶、 单链结合蛋白， 与其他恒温扩增技术相比(doi.org/10.1371/ journal.po ne.0103091)， 该技 术比较简单、 反应迅速、 对反应设备要求低。 发明内容 [0005]本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足， 提供一种基于CRISPR ‑Cas12a可 视化检测多杀性巴氏杆菌的试剂盒。 [0006]本发明的第一目的是提供一种组合物。说　明　书 1/13 页 3 CN 115029459 A 3