(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211029719.9 (22)申请日 2022.08.25 (71)申请人 成都医学院 地址 610036 四川省成 都市金牛区蓉都大 道天回路6 01号 (72)发明人 王频佳　谢成彬　 (74)专利代理 机构 成都金英专利代理事务所 (普通合伙) 51218 专利代理师 徐立宁 (51)Int.Cl. C12Q 1/686(2018.01) C12Q 1/6806(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种同时制备多种病毒RNA片段用作核酸检 测阳性对照的方法 (57)摘要 本发明公开了同时制备多种病毒RNA片段用 作核酸检测阳性对照的方法。 所述方法包括以下 步骤： 体外合成多种待检测病毒的保守区核苷酸 序列， 将各序列分别插入到质粒载体中， 获得含 有病毒保守序列的重组质粒； 以所述各病毒的保 守序列作为靶序列设计用于PCR扩增的特异性引 物对； 设计并合成一对非特异性通用引物， 其中 正义引物含有T7  RNA聚合酶的同源启动子序列； 将通用引物与各病毒特异性引物相连， 形成针对 各种待检测病毒的嵌合引物对； 以重组质粒为模 板， 采用Tem ‑PCR技术， 使用多对嵌合引物和一对 通用引物进行病毒核酸的扩增； 基于体外转录技 术将多重PCR的产物转录为RAN片段。 本发明操作 简单， 成本低廉， 可同时制备多种病毒保守区序 列RNA片段。 权利要求书2页 说明书12页 附图3页 CN 115418396 A 2022.12.02 CN 115418396 A 1.一种同时制备多种 病毒RNA片段用作核酸检测阳性对照的方法， 包括以下步骤： 体外合成多种待检测病毒的保守区核苷酸序列， 将各序列分别插入到质粒载体中， 获 得含有病毒保守序列的重组质粒， 作为后续PCR的模板； 以所述多种待检测病毒的保守序列 作为靶序列设计用于PCR扩增的特异性引物对； 设计并合成一对非特异性通用引物， 并保证该非特异性通用引物对与待测病 毒无同源 性， 所述非特异性通用引物的正义引物为含有T7  RNA聚合酶的同源启动子序列， 即5' ‑   TAATACGACTCACTATAG GG  ‑3'； 合成所述多种待检测病毒的嵌合引物对； 以重组质粒为模板， 采用Tem ‑PCR技术， 将多对嵌合引物和一对通用引物进行病毒核酸 的扩增， 获得PCR产物； 以上述PCR产物作为体外转录模板， 将DNA转录为RNA； 将RNA储存在‑20°C～‑70°C备用。 2.根据权利要求1所述一种同时制备多种病 毒RNA片段用作核酸检测阳性对照的方法， 其特征在于， 所述多种待检测病毒包括： A组轮状病毒、 诺如病毒GI型、 诺如病毒GII型、 星状 病毒和札如病毒。 3.根据权利要求1所述一种同时制备多种病 毒RNA片段用作核酸检测阳性对照的方法， 其特征在于， 所述质粒 载体包括pUC 57载体。 4.根据权利要求1所述一种同时制备多种病 毒RNA片段用作核酸检测阳性对照的方法， 其特征在于， 所述非特异性 通用引物的反义引物序列为SEQ  ID No .1。 5.根据权利要求1所述一种同时制备多种病 毒RNA片段用作核酸检测阳性对照的方法， 其特征在于， 还 包括对转录 本进行纯化的步骤， 以便除掉模板、 核苷酸和蛋白质。 6.根据权利要求5所述一种同时制备多种病 毒RNA片段用作核酸检测阳性对照的方法， 其特征在于， 所述嵌合引物是将非特异 性通用引物的正义引物和反义引物分别与所述病毒 的特异性引物对中的正 义引物和反义引物的5 ’端相连， 形成碱基数目为3 5~40nt的长引物。 7.根据权利要求6所述一种同时制备多种病 毒RNA片段用作核酸检测阳性对照的方法， 其特征在于， 每一对嵌合引物5 ’端都带有一个能被通用引物识别的标签序列， 所有正义嵌 合引物的5 ’端的标签序列为含有 T7 RNA聚合酶的同源启动子序列。 8.根据权利要求1所述一种同时制备多种病 毒RNA片段用作核酸检测阳性对照的方法， 其特征在于， 扩增后Tem ‑PCR的主要成分包括PCR  Mix Buffer、 通用引物对、 多种待检测病 毒的嵌合引物对， 多种病毒的重组质粒和ddH2O； 所述PCR  Mix Buffer为2 ×PCR Mix  Buffer或10×PCR Mix Buffer。 9.根据权利要求8所述一种同时制备多种病 毒RNA片段用作核酸检测阳性对照的方法， 其特征在于， 所述嵌合引物和通用引物的摩尔浓度比为1： 2~5。 10.根据权利要求9所述一种同时制备多种病毒RNA片段用作核酸检测阳性对照的方 法， 其特征在于， 所述嵌合引物和通用引物的摩尔浓度比为1： 5 。 11.根据权利要求1所述一种同时制备多种病毒RNA片段用作核酸检测阳性对照的方 法， 其特征在于， 所述Tem ‑PCR的扩增条件为： 第一步： 94℃ 30s， 55~58℃ 15s， 72℃  60s， 扩增反应15个 循环； 第二步： 94℃ 30s， 72℃ 90s， 扩增反应6个 循环；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115418396 A 2第三步： 94℃ 20s， 46℃ 20s， 72℃ 20s， 扩增反应3 5个循环。 12.根据权利要求1所述一种同时制备多种病毒RNA片段用作核酸检测阳性对照的方 法， 其特征在于， 所述PCR产物体外转录含有： 20 μl 体外转录体系中含有： 5X  TranscriptAid  Reaction  Buffer 4 μl、 ATP/CTP/ GTP/UTP mix 8 μl或Transcript Aid Enzyme Mix 2 μl； PCR产物或胶回收产物  2 μl； DEPC 处理水2 μl； 反应条件： 37 °C孵育2小时。 13.根据权利要求2所述一种同时制备多种病毒RNA片段用作核酸检测阳性对照的方 法， 其特征在于， 所述A组轮状病毒的嵌合引物对： 正义引物序列为SEQ  ID No .2， 反义引物 序列为SEQ  ID No .3。 14.根据权利要求2所述一种同时制备多种病毒RNA片段用作核酸检测阳性对照的方 法， 其特征在于， 所述诺如病毒GI型的嵌合引物对： 正义引物的序列为SEQ  ID No .4， 反义 引物序列为SEQ  ID No .5。 15.根据权利要求2所述一种同时制备多种病毒RNA片段用作核酸检测阳性对照的方 法， 其特征在于， 所述诺如病毒GII型的嵌合引物对： 正义引物序列为SEQ  ID No .6； 反义引 物序列为SEQ  ID No .7。 16.根据权利要求2所述一种同时制备多种病毒RNA片段用作核酸检测阳性对照的方 法， 其特征在于， 所述星状病毒的嵌合引物对： 正义引物序列为SEQ  ID No .8反义引物序列 为SEQ ID No .9。 17.根据权利要求2所述一种同时制备多种病毒RNA片段用作核酸检测阳性对照的方 法， 其特征在于， 所述札如病毒的嵌合引物对： 正义引物序列为SEQ  ID No .10， 反义引物序 列为SEQ ID No .11。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115418396 A 3