(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210608598.7 (22)申请日 2022.05.31 (71)申请人 广东双螺 旋基因技术有限公司 地址 528400 广东省中山市 火炬开发区生 物谷大道12号A8幢5楼 (72)发明人 张璜　陈业星　林雪金　高金艳　 冯伟聪　炎雪芳　王志坤　 (74)专利代理 机构 广州凯东知识产权代理有限 公司 44259 专利代理师 曾志环 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种可避免假阴性的对虾黄头病毒核酸检 测试剂盒 (57)摘要 本发明公开了一种可避免假阴性的对虾黄 头病毒核酸检测试剂盒。 该试剂盒包含一组检测 对虾黄头病毒的引物组和一组检测对虾属 内参 基因的引物组， 所述两组引物组均包括一对特异 性引物及对应的TaqMan探针， 试剂盒还包 括一管 式的反应预混液， 阳性对照参考品和阴性对照参 考品。 本发 明提供的一管式分装 试剂盒可直接从 复杂样品中检测对虾黄头病毒， 具有特异性强、 灵敏度高、 实验重复性好、 操作便捷快速的优点， 不需要昂贵的仪器 即可完成检测， 并且内参基因 可以全程监控检测过程， 有效避免假阴性结果出 现。 可用于对虾黄 头病毒的快速、 准确检测。 权利要求书1页 说明书9页 序列表2页 附图10页 CN 114807449 A 2022.07.29 CN 114807449 A 1.一组检测对虾黄头病 毒的引物 组， 其特征在于， 所述引物组由正向引物F、 反向引物R 和荧光探针Q组成， 所述正向引物F的核苷酸序列如SEQ  ID NO:1所示， 反向引物R的核苷酸 序列如SEQ  ID NO:2所示， 荧 光探针Q的核苷酸序列如SEQ  ID NO:3所示。 2.一组检测对虾属内参基因的引物组， 其特征在于， 所述引物组由正向引物F、 反向引 物R和荧光探针Q组成， 所述正向引物F的核苷 酸序列如S EQ ID NO:4所示， 反向引物R的核苷 酸序列如SEQ  ID NO:5所示， 荧 光探针Q的核苷酸序列如SEQ  ID NO:6所示。 3.根据权利要求1和权利要求2所述的引物 组， 其特征在于， 所述荧光探针Q的5 ’端标记 荧光基团， 3 ’端标记淬灭基团。 4.一种检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包含权利要求1或3所述的检测对虾黄头 病毒的引物组， 还 包含权利要求2或3所述的检测对虾属内参基因的引物组。 5.根据权利 要求4所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒中还包含0.2ml规格PCR独盖 管的一管式的反应预混液， 阳性对照参考品和阴性对照参考品。 其中反应预混液包括DNA聚 合酶， 反转录酶， UNG酶， 2 ×反应缓冲液， 密封液。 6.根据权利要求5所述 的试剂盒， 其特征在于， 所述DNA聚合酶为Tth  DNA polymerase 和热启动抗体的混合液， 反转录酶为M ‑MLV逆转录酶， UNG酶为尿嘧啶 ‑N‑糖基化酶， 2×反应 缓冲液是含有dATP、 dCTP、 dGTP和dU TP的2×浓度的反应溶 液， 密封液为矿物油。 7.根据权利要求5所述的试剂 盒， 其特征在于， 所述阳性对照 参考品为含有对虾黄头病 毒检测靶标基因的质粒DNA， 所述阳性对照参 考品为无RNA酶的去离 子水。 8.根据权利要求5所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒的反应体系为： 对虾黄头病 毒的引物组的正向引物F、 反向引物R和荧光探针Q引物在反应体系中的终浓度分别为0.4～ 0.6 μM、 0.4～0.6 μM和0.2～0.3 μM； 对虾属内参基因的引物组正向引物F、 反向引物R和荧光 探针Q引物在反应体系中的终浓度分别为0.2～0.4 μM、 0.2～0.4 μM和0.1～0.2 μM； 2 ×反应 缓冲液12.5 μL， DNA聚合酶2～4U， 反转录酶2～4U、 UNG酶0.3～0.5U， 待检样品2～5 μL， 加无 RNA酶的去离 子水至25 μL。 9.根据权利要求8所述的试剂盒， 其特征在于， 所述反应体系的反应条件为50℃5min； 95℃5min； 95℃15s、 6 0℃30s， 45个循环。 10.权利要求 4～8任一所述试剂盒在检测对虾黄 头病毒中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114807449 A 2一种可避免假阴性的对虾黄头病毒核酸检测试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及微生物检测技术领域， 具体地， 涉及一种可避免假阴性的对虾黄头病 毒核酸检测试剂盒。 背景技术 [0002]黄头病((Yellowhead  disease， YHD)因病虾头胸 部肝胰腺呈黄色故名黄头病， 我 国将其列为二类动物疫病， 是世界动物卫生组织(OIE)必须申报的疾病。 是对虾的主要病害 之一， 由黄 头病毒(Yel low head disease,Y HV)引起。 [0003]黄头病严重影响养殖期为50 天～70天对虾， 感染后3 天～5天内发病率高达 100％， 死亡率可以达到达8 0％～90％。 能感染我国主养的3种经济种类凡纳滨对虾、 罗氏沼虾和中 国明对虾， 并已在山东和浙江两个省份引起了对虾的死亡并造成了一定的经济损失， 这说 明YHV已经有开始蔓延的趋势， 对我国的对虾养殖业具有潜在的巨大威胁。 [0004]在PCR体系中加入扩增内参， 是PCR检测技术标准化的措施之一。 内参是在PC R体系 中加入一段人工合成的DNA序列， 在进行靶标基因的扩增时， 内参基因也进行扩增， 并且由 于靶标基因与内参基因在两个通道各自进行扩增， 两个基因并不会互相 干扰， 所以也不会 对检测结果造成影响。 一般来说内参基因在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定， 受环境因素影响小， 内标定量结果代 表了样本中所含细胞或基因 组数量。 [0005]在PCR目前分子生物 学检测中应用较多的方法是聚合酶链式反应(PC R)， 其检测过 程PCR仪还需要搭配电泳仪和凝胶成像仪使用， 操作步骤多， 耗时长， 且过程易造成气溶胶 污染。 实时荧光定量PCR(Quantitative  Real－time  PCR)是在 常规PCR技术的基础上添加 荧光染料或荧光探针， 利用荧光信号积累实时监测整个P CR进程， 通过标准曲线对 未知浓度 模板进行定量分析的方法。 与普通PCR技术相比， 实时荧光定量PCR技术的TaqMan探针特异 性强， 可进行 单个核苷酸的区分， 同时操作更简便， 检测时间更短。 发明内容 [0006]本发明在现有技术的基础上进行了改进措施， 提供了一种可避免假阴性的对虾黄 头病毒核酸检测试剂盒。 该试剂盒包含一组检测对虾黄头病毒的引物组和一组检测对虾属 内参基因的引物组， 所述两组引物组均包括一对特异性引物及对应的TaqMan探针， 试剂盒 还包括0.2ml规格PCR独盖管的一管式的反应预混液， 阳性对照参考品和阴性对照参考品。 本发明提供的试剂盒可直接从复杂样品中检测对虾黄头病毒， 具有 特异性强、 灵敏度高、 实 验重复性好和操作便捷快速的优点， 同时设计内参基因引物作为内部参照， 避免因样品核 酸问题或者试剂失效导致的假阴性结果； 0.2ml规格PCR独盖管， 可以与大部 分荧光PCR仪匹 配检测， ， 并且一管式适用于对虾黄 头病毒的现场快速、 准确检测。 [0007]本发明的第一个目的是提供一组检测对虾黄头病毒的引物组和一组检测对虾属 内参基因的引物组。 [0008]本发明的第二个目的是提供一种带内参的检测试剂盒， 具有特异性强、 灵敏度高、说　明　书 1/9 页 3 CN 114807449 A 3