(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210646146.8 (22)申请日 2022.06.08 (71)申请人 扬州大学 地址 225000 江苏省扬州市大 学南路88号 (72)发明人 李向东　侯闻闻　余良政　朱振邦　 刘盼娆　 (74)专利代理 机构 北京风雅颂专利代理有限公 司 11403 专利代理师 李翔 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种可快速鉴别猪群腹泻症候群病原的 iiPCR试剂盒及其使用方法 (57)摘要 本发明涉及动物病毒学技术领域， 具体涉及 一种可快速鉴别猪群腹泻症候群病原的iiPCR试 剂盒及其使用方法， 试剂盒包括iiPCR扩增液， 所 述iiPCR扩增液包 括Taq DNA聚合酶、 MMLV反转酶 和引物探针组， 所述引物探针组包括第一引物对 及第一探针、 第二引物对及第二探针、 第三引物 对及第三探针、 第四引物对及第四探针。 本发明 针对临床中猪的肠道内容物、 粪便、 肛门拭子等 样品， 经核酸提取， 可直接将RNA作为模板， 即可 完成iiPCR检测， 特异性良好， 且灵 敏度与荧光定 量PCR相当。 权利要求书1页 说明书8页 序列表4页 CN 114934137 A 2022.08.23 CN 114934137 A 1.一种可快速鉴别猪群腹泻症候群病原的iiPCR试剂盒， 其特征在于， 包括iiPCR扩增 液， 所述iiPCR扩增液包括Taq  DNA聚合酶、 MMLV反转 酶和引物探针组， 所述引物探针组包括 第一引物对及第一探针、 第二引物对及第二探针、 第三引物对及第三探针、 第四引物对及第 四探针， 所述第一引物对包括如SEQ  ID NO.1所示的PEDV上游引物和如SEQ  ID NO.2所示的 PEDV下游引物， 所述第一探针包括如SEQ  ID NO.3所示的PEDV探针， 所述第二引物对包括如 SEQ ID NO.4所示的TGEV上游引物和如SEQ  ID NO.5所示的TGEV下游引物， 所述第二探针包 括如SEQ ID NO.6所示的TGEV 探针， 所述第三引物对包括如SEQ  ID NO.7所示的PoRV上游引 物和如SEQ  ID NO.8所示的PoRV下游引物， 所述第三探针包括如SEQ  ID NO.9所示的PoRV探 针， 所述第四引物对包括如SEQ  ID NO.10所示的PDCoV上游引物和如SEQ  ID NO.11所示的 PDCoV下游引物， 所述第四探针包括如SEQ  ID NO.12所示的P DCoV探针。 2.根据权利要求1所述可快速鉴别猪群腹泻症候群病原的iiPCR试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还 包括阳性对照和阴性对照。 3.根据权利要求2所述可快速鉴别猪群腹泻症候群病原的iiPCR试剂盒， 其特征在于， 所述阳性对照为进行灭活处理过的PEDV、 TGEV、 PoRV、 PDCoV病毒液， 接毒剂量为1 × 106TCID50/mL； 阴性对照为 Nuclease ‑free水。 4.根据权利要求1所述可快速鉴别猪群腹泻症候群病原的iiPCR试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还 包括待测样品。 5.根据权利要求4所述可快速鉴别猪群腹泻症候群病原的iiPCR试剂盒， 其特征在于， 所述待测样品为猪的肠内容物、 粪便或肛门拭子中的一种。 6.根据权利要求1所述可快速鉴别猪群腹泻症候群病原的iiPCR试剂盒， 其特征在于， 所述iiPCR扩增液的用量为48μl， 添加模板量为2μl， iiPCR扩增液包括(Premix缓冲液) dNTP、 Tris ‑Buffer、 EDTA、 DTT、 甘油和Tween ‑20， 含量分别为0.5mM、 10mM、 0.05mM、 0.05mM、 30％V/V和0.1％V/V， Taq DNA聚合酶的浓度0.1U/ μl、 MMLV反转录酶的浓度为0.5U/ μl， PEDV 上游引物、 TGEV上游引物、 PoRV上游引物、 PDCoV上游引物、 PEDV下游引物、 TGEV下游引物、 PoRV下游引物和PDCoV下游引物的浓度均为1 μM， 第一探针、 第二探针、 第三探针和第四探针 的浓度均为0.0 5 μM， 所述模板为猪的肠道内容物、 粪便或肛门拭子提取的核酸RNA。 7.根据权利要求1所述可快速鉴别猪群腹泻症候群病原的iiPCR试剂盒， 其特征在于， 所述第一探针、 第二探针、 第三探针、 第四探针的5 ’端均使用FAM荧光报告基团， 3 ’端均使用 MGB荧光淬灭基团。 8.根据权利要求1 ‑7任一项所述可快速鉴别猪群腹泻症候群病原的iiPCR试剂盒的使 用方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： 步骤一、 取 试剂盒中的i iPCR扩增液分装至i iPCR反应管中， 瞬时离心； 步骤二、 取待检样品加入到步骤一准备好的iiPCR反应管中， 瞬时离心后置入iiPCR仪 器； 步骤三、 选择520nm单通道荧光波长进行检测， 待iiPCR仪器反应结束后， 读取判定结 果。 9.根据权利要求8所述可快速鉴别猪群腹泻症候群病原的iiPCR试剂盒的使用方法， 其 特征在于， 所述 iiPCR仪器采用手持式POCKITTM Micro Duo核酸分析仪 。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114934137 A 2一种可快速鉴别猪群腹泻症候群病原的i iPCR试剂盒及其使 用方法 技术领域 [0001]本发明涉及动物病毒学技术领域， 尤其涉及一种可快速鉴别猪群腹泻症候群病原 的iiPCR试剂盒及其使用方法。 背景技术 [0002]随着我国生猪产业集约化养殖的普及， 多种病原可引起相似的临床症状  (称之为 “症候群”)， 临床中很难通过大体剖检进 行确诊， 因此需要对同一症候群下的不同病原进 行 鉴别诊断。 仔猪病毒性腹泻就是阻碍中国养猪业健康发展的一种典型 的多因素性疾病。 猪 流行性腹泻病毒(Porcine  epidemic diarrhea  virus,PEDV)、 猪传染性胃肠炎病毒 (Porcine  transmissible gastroenteritis  virus,TGEV)、 猪轮状病毒(Porcine   rotavirus,PoRV)以及猪德尔塔 冠状病毒(Porcine  deltacoronavirus,PDCoV)是当前引起 猪病毒性腹泻的主要病原， 各种年龄段的猪群均易感染， 特别是对新生仔猪危害最为严重， 其临床症状具有相似性， 均表现为腹泻、 呕吐、 脱水和食欲下降等， 在病理变化和流行病学 等方面也极为相似， 且这四种病毒常呈混合感染， 给猪病的监测和诊断造成了困难。 因此， 确定哪种 病毒是引起该症候群的主 要病原是采取相应防控措施的首要问题。 [0003]根据S基因的分子特性， PEDV可以分为2个基因大群， 目前我国流行的主要是PEDV 变异毒株(基因型 Ⅱb)， 而TGEV不同地区来源的各毒株间S基因差异性不大， S基因变异 仍较 低且相对比较稳定， 这有可能是目前TGEV感染率较低的原因。 我国流行的Po RV基因型为G9、 G11、 G2、 G4、  G5、 G26和G3， P基因型为P[6]、 P[7]、 P[13]、 P[19]、 P[23]和P[34]， 其中以P [13]、 P[19]、 P[23]为主。 当前从各大洲分离到的PoRV最流行的毒株仍是OSU， 其基因型 组合 为G5P[7]， 我国主要流行的也是该株轮状病毒。 各地猪场分离出的P EDV阳性率最高， 其次是 PoRV， TGEV则较低， 近些年  PDCoV的发病率有上升的趋势。 PEDV常与TGEV、 PoRV等混合感染,   TGEV/PoRV混合感染较少或不存在， 不同地区猪场混合感染存在差异。 许多地区存在TGEV/ PEDV、 TGEV /PoRV、 PEDV /PoRV双重感染或  PEDV/TGEV/PoRV三重感染， 但以PEDV /PoRV双重感 染为主。 [0004]传统的PC R检测技术必须在专业实验室才能进行操作， 需要专门的仪器设备， 操作 步骤繁琐， 耗时长、 成本高， 操作人员需要专业培训。 因此， 对病原学检测， 开发及时检测 (Point‑of‑care testing,POCT)技术， 在现场采样即可进行分析， 省去样品在实验室检验 时的处理程序， 能够快速、 精准得到检测结果的诊断技术是现代兽用疫病诊断的市场需求 和发展趋势。 [0005]快速、 精准的现场诊断对该病的防治尤为重要， 病原检测可以提供感染的直接证 据。 2002年Krishnar等对荧光定量PCR检测仪器进行了改进和创新， 研发出基于TaqMan探针 原理的恒温隔绝式PCR(insuate d isothermal PCHiiPCR)系列检测仪， 其中手持式POCKIT 自重仅380g， 自带电源， 一键操作即可在42min内完成检测， 结果直接显示在液晶屏上， 实现 了病原分子检测的小 型化、 便捷化， 特别适用于现场的快速诊断。 目前国外已建立了虾白斑说　明　书 1/8 页 3 CN 114934137 A 3