(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210792976.1 (22)申请日 2022.07.05 (71)申请人 东南大学 地址 210096 江苏省南京市玄武区新 街口 街道四牌楼 2号 (72)发明人 丁雄　王雅茹　 (74)专利代理 机构 北京同辉知识产权代理事务 所(普通合伙) 11357 专利代理师 何静 (51)Int.Cl. C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种变性巢式硫代磷酸化等温核酸扩增方 法 (57)摘要 本发明公开了一种变性巢式硫代磷酸化等 温核酸扩增方法， 该方法包括硫代磷酸化外引 物、 硫代磷酸化双链内引物、 线 性引物、 核苷酸聚 合酶、 核酸嵌合染料、 目标核酸序列、 变性剂尿 素， 所述变性剂尿素可辅助引物退火和延伸产物 自匹配， 所述硫代磷酸化序列由硫代磷酸化核苷 酸组成且可发生自匹配， 所述硫代磷酸化双链内 引物其内部为硫代磷酸化双链结构、 两侧为可识 别目标核酸序列的单链结构， 所述硫代磷酸化外 引物序列、 硫代磷酸化双链内引物的两侧单链序 列能与内外巢式分布的目标核酸序列位点特异 性结合并被延伸。 本发明方法在低温条件下利用 核酸嵌入染料即可实现高特异性核酸扩增检测， 有望降低便携式等温核酸检测装置的设计难度 和能量消耗。 权利要求书2页 说明书11页 附图5页 CN 115287337 A 2022.11.04 CN 115287337 A 1.一种变性巢式硫代磷酸化等温核酸扩增方法， 其特征在于， 包括变性剂尿素解链辅 助引物退火和延伸产物自匹配、 硫代磷酸化序列自匹配、 指数循环扩增， 其特征在于， 所述 等温核酸扩增方法所采用的试剂包含硫代磷酸化上游外引物、 硫代磷酸化下游外引物、 硫 代磷酸化双链内引物、 上游线性引物、 下游线性引物、 具有链置换活性的核苷酸聚合酶、 核 酸嵌合染料、 目标核酸序列、 变性剂 尿素， 所述硫代磷酸化上和下游外引物是由两个目标核 酸序列位点组合而成的单链， 所述两个位点分别作为引物的5 ′端和3′端序列， 所述5 ′端引 物序列核苷酸均为硫代磷酸化修饰， 所述硫代磷酸化双链内引物是由四个目标核酸序列位 点组成的、 内双链 ‑外单链的复合体， 所述内双链结构是 由两个完全互补的、 均被硫代磷酸 化修饰的位点配对形成， 所述外单链结构是指复合体两侧均含能与目标核酸序列识别并被 延伸的单链； 所述上和下游线性引物是由单个目标核酸序列位 点组成； 所述等温核酸扩增的过程， 包括： a)在变性剂尿素辅助目标核酸序列解链下， 上下游线性引物分别与目标核酸序列位点 特异性结合， 在核苷酸聚合酶作用下， 以目标序列为模板， 沿着目标序列5 ′端进行延伸， 延 伸产物将进一 步打开目标核酸序列， 暴露出其 他引物的识别位 点； b)硫代磷酸化上下游外引物和硫代磷酸化双链内引物分别与各自的目标核酸序列位 点特异性结合， 在核苷酸聚合酶作用下， 以目标序列为模板， 沿着目标序列5 ′端进行延伸， 延伸产物与目标序列形成双链或被置换 形成一端含双链结构的单链； c)所述b)中双链延伸产物形在变性剂尿素解链辅助下会发生硫代磷酸化序列自匹配， 继而再次暴露目标序列位 点， 被对应硫代磷酸 化引物识别后介导循环扩增； d)所有引物以b)中所述单链延伸产物为模板， 在核苷酸聚合酶作用下进入以5 ′端硫代 磷酸化序列自匹配成环、 3 ′端序列自匹配成环并延伸、 引物识别环上序列并延伸为主要步 骤的指数循环扩增阶段。 2.根据权利要求1所述的变性巢式硫代磷酸化等温核酸扩增方法， 其特征在于， 所述硫 代磷酸化上游外引物序列、 硫代磷酸化下游外引物序列、 硫代磷酸化双链内引物的两侧单 链序列均与目标核酸序列特异性结合， 所 结合的位 点呈内外巢式分布。 3.根据权利要求1所述的变性巢式硫代磷酸化等温核酸扩增方法， 其特征在于， 所述硫 代磷酸化上游外引物和下游外引物均包含两个目标位点， 分别构成引物的5 ′端和3′端序 列， 其中5 ′端序列为硫代磷酸 化核苷酸。 4.根据权利要求1所述的变性巢式硫代磷酸化等温核酸扩增方法， 其特征在于， 所述硫 代磷酸化双链内引物包含四个目标位点， 共同构成内部双链、 两侧单链的二元复合体， 其中 双链结构均为硫代磷酸 化核苷酸， 两侧单链分别识别目标核酸序列上不同的位 点。 5.根据权利要求1所述的变性巢式硫代磷酸化等温核酸扩增方法， 其特征在于， 所述上 游线性引物和下游线性引物均由单个目标位 点构成， 其核苷酸数 大于等于15， 小于等于25 。 6.根据权利要求4所述的上游线性引物和下游线性引物， 其特征在于， 其位点序列与硫 代磷酸化上游外引物和下游外引物的5 ′端序列重合， 重合核苷酸数大于等于0， 小于等于 25。 7.根据权利要求2所述的硫代磷酸化上游外引物和下游外引物， 其特征在于， 构 成其5′ 端和3′端序列的两个位 点核苷酸数均为大于等于15， 小于等于25 。 8.根据权利要求3所述的硫代磷酸化双链内引物， 其特征在于， 构成其内部双链 ‑两侧权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115287337 A 2单链的四个目标位 点的核苷酸数均大于等于15， 小于等于25 。 9.根据权利要求1所述的变性巢式硫代磷酸化等温核酸扩增方法， 其特征在于， 所述的 目标核酸序列为样本中DNA序列、 样本RNA序列、 样本中DNA与RNA混合序列、 样本中DNA序列 的预扩增产物或样本中RNA序列的预扩增产物。 10.根据权利要求1所述的变性巢式硫代磷酸化等温核酸扩增方法， 其特征在于， 所述 具有链置换活性的核苷酸聚合酶为Bacillus  stearothermophilus(Bst)DNA聚合酶、 Bacillus  smithii(Bsm)DNA聚合酶、 Bacillus  subtilis(Bsu)DNA聚合酶、 phi29  DNA聚合 酶和Vent(exo ‑)DNA聚合酶中一种或多种的组合。 11.根据权利要求1所述的变性巢式硫代磷酸化等温核酸扩增方法， 其特征在于， 所述 的核酸嵌合染料为SYBR  Green系列、 SYTO系列和EvaGre en系列中一种。 12.根据权利要求1所述的变性巢式硫代磷酸化等温核酸扩增方法， 其特征在于， 所述 的变性剂尿素浓度大于等于 0mol/L， 小于等于15mo l/L。 13.根据权利要求3所述的目标核酸序列， 其特征在于， 预扩增产物来源于核酸扩增方 法为聚合酶链式反应、 逆转录聚合酶链式反应、 环介导等温扩增、 逆转录环介导等温扩增、 重组酶聚合酶反应、 逆转录 重组酶聚合酶反应、 解旋酶扩增 和逆转录解旋酶扩增中一种。 14.一种等温核酸扩增试剂 盒， 包括： 硫代磷酸化外引物、 硫代磷酸化双链内引物、 线性 引物、 核苷 酸聚合酶、 核酸嵌合染料、 目标核酸序列、 变性剂 尿素， 所述变性剂 尿素可辅助引 物退火和延伸产物自匹配， 所述硫代磷酸化序列 由硫代磷酸化核苷酸组成且可发生自匹 配， 所述硫代磷酸化双链内引物其内部为硫代磷酸化双链结构、 两侧 为可识别目标核酸序 列的单链结构， 所述硫代磷酸化外引物序列、 硫代磷酸化双链内引物的两侧单链序列能与 内外巢式分布的目标核酸序列位 点特异性结合并被延伸。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115287337 A 3