(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210874581.6 (22)申请日 2022.07.21 (71)申请人 北京寻因生物科技有限公司 地址 102200 北京市昌平区生命科 学园生 命园路8号院一区9号-1至5层101(A座 2层201室) (72)发明人 桑国芹　石焕焕　韩金桓　罗云超　 孙佳成　赵萌　谢莹莹　李研　 关荧　韦秋霞　焦少灼　李宗文　 (74)专利代理 机构 北京恒程知识产权代理有限 公司 11914 专利代理师 许峰 (51)Int.Cl. C12N 15/113(2010.01) C40B 40/06(2006.01)C40B 50/06(2006.01) C12Q 1/6806(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种功能序列、 包 含其的标签 群以及应用 (57)摘要 本发明属于单细胞建库领域， 具体涉及一种 功能序列、 包含其的标签群以及应用， 所述功能 序列包括： 标签体以及与所述标签体连接的接头 1； 其中， 所述标签体包括细胞标签。 本发明中， 通 过在细胞标签上连接上接头1， 可 以使其进行组 合成标签群后， 配合游离的逆转录引物， 即可对 于不同细胞的cDNA进行细胞标签标记， 以此可以 进行单细胞检测。 通用性强， 不仅可 实现3’、 5’及 全序列单细胞转录组的检测， 也可以适用于各种 目标RNA的设计， 同时配合使用封闭体系， 进一步 的避免细胞间的污染， 使 得可以进行高通量单细 胞检测。 权利要求书2页 说明书14页 附图6页 CN 115261389 A 2022.11.01 CN 115261389 A 1.一种功能序列， 其特 征在于， 所述功能序列包括： 标签体以及连接在所述标签 体一端的接 头1； 其中， 所述标签 体包括细胞 标签。 2.如权利要求1所述的功能序列， 其特 征在于， 所述标签 体还包括分子标签； 和/或， 所述功能序列还 包括引物结合序列， 所述引物结合序列连接在所述标签 体的另一端。 3.一种标签群， 其特征在于， 所述标签群包括多个细胞标签群， 各所述细胞标签群包括 多条如权利要求 1或2所述的功能序列， 同一所述细胞标签群的多 条所述功能序列的所述细 胞标签相同， 且不同所述细胞 标签群的多条 所述功能序列的所述细胞 标签不同。 4.如权利 要求3所述的标签群， 其特征在于， 各所述细胞标签群包括105～1010条功能序 列； 和/或， 所述功能序列还 包括分子标签， 各 所述功能序列的所述分子标签不同； 和/或， 各所述细胞标签群还包括一个微珠本体， 各所述细胞标签群的多条所述功能序列与对 应的所述 微珠本体连接， 且各 所述功能序列 与所述微珠本体可 条件性断开。 5.一种单细胞RNA建库方法， 其特 征在于， 所述单细胞RNA建库方法包括以下步骤： 将多个细胞的目标RNA、 逆转录体系、 连接体系和如权利要求3所述的标签群采用封闭 体系封闭， 形成多个封闭反应体系， 其中， 各所述封闭反应体系中包含同一细胞的多个目标 RNA和一个所述细胞标签群， 不同所述封闭反应体系中包含不同的所述细胞标签群和不同 细胞的多个的所述目标RNA； 在各所述封闭反应体系中， 在所述逆转录体系作用下进行逆转录反应得到多条cDNA， 且各所述cDNA具有接 头1’； 将各所述封闭反应体系中的得到的多条所述cDNA在所述连接体系作用下， 所述接头1 ’ 与各功能序列的所述接 头1一一对应形成双链后， 得到标记cDNA； 将所述标记cDNA进行富 集， 并引入文库标签， 得到单细胞RNA测序文库。 6.如权利要求5所述的单细胞RNA建库方法， 其特征在于， 各所述细胞标签群还包括一 个微珠本体， 各所述细胞标签群的多条所述功能序列与对应的所述微珠本体连接， 且各所 述功能序列 与所述微珠本体可 条件性断开； 所述将各所述封闭反应体系中的得到的多条所述cDNA在所述连接体系作用下， 所述接 头1’与各所述功能序列的所述接 头1一一对应形成双链后， 得到所述标记cDNA的步骤 包括： 将各所述功能序列与所述微珠本体条件性断裂， 裂解微珠本体后， 将各所述封 闭反应 体系中的得到的多 条所述cDNA的所述接头1 ’与各所述功能序列的所述接头1一一对应形成 双链后， 得到所述标记cDNA。 7.如权利要求5所述的单细胞RNA建库方法， 其特征在于， 所述逆转录体系包括逆转录 引物和逆转录酶， 所述逆转录引物包括正向引物和反向引物， 其中， 所述正向引物包括逆转 录序列以及第一序列， 所述逆转录引物可对所述目标RNA进 行逆转录， 所述反向引物包括第 二序列以及第三序列， 所述第一序列与所述第二序列 互补， 所述第三序列与所述所述接头 1’的序列一 致； 和/或， 所述连接体系包括DNA连接酶。 8.如权利要求7所述的单细胞RNA建库方法， 其特征在于， 所述逆转录序列包括随机序 列和/或固定序列， 所述功能序列包括分子标签， 所述分子标签与所述细胞标签共同构成标 签体； 和/或，权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115261389 A 2所述逆转录酶具有模板转换功能， 所述逆转录体系还 包括模板转换序列； 和/或， 所述逆转录引物还包括第一链合成引物， 所述第一链合成引物用于cDNA第一链的合 成。 9.如权利要求8所述的单细胞RNA建库方法， 其特征在于， 所述将多个细胞的目标RNA、 逆转录体系、 连接体系和所述标签群采用封闭体系封闭， 形成多个封闭反应体系的步骤包 括： 制备多个细胞相体系， 各所述细胞相体系包括一个细胞、 所述逆转录体系以及所述连 接体系； 准备多个标签相， 所述标签相包 含一个细胞 标签群及表面活性剂； 所述封闭体系为油相， 将各个所述细胞相体系及标签相分别采用所述封闭体系进行封 闭， 待所述细胞裂解， 释放出对应细胞的多个所述目标RNA， 形成多个油包水的封闭反应体 系。 10.一种单细胞RNA建库试剂盒， 其特 征在于， 所述单细胞RNA建库试剂盒包括： 如权利要求3所述的标签 群； 逆转录体系， 所述逆转录体系用于将目标RNA进行逆转录得到cDNA， 所述cDNA具有接头 1’， 所述接头1’可与所述接 头1形成双链； 连接体系， 所述连接体系用于DNA连接； 封闭体系， 所述封闭体系用于将多个细胞的目标RNA、 所述逆转录体系、 所述连接体系 和所述标签群封闭， 形成多个封闭反应体系， 同一所述封闭反应体系中包含同个细胞的多 个目标RNA和一个细胞标签群， 不同所述封闭反应体系中包含不同的细胞标签群和不同细 胞的多个的目标RNA； 以及， 富集建库体系， 所述富集建库体系用于将所述cDNA进行扩增并通过index  PCR加上样 品文库标签。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115261389 A 3