(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210611146.4 (22)申请日 2022.06.01 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114686524 A (43)申请公布日 2022.07.01 (73)专利权人 中山大学 地址 510275 广东省广州市海珠区新港西 路135号 (72)发明人 张晋　李水生　张勇　彭诚　 卢丹琪　李桂峰　 (74)专利代理 机构 广州知友专利商标代理有限 公司 44104 专利代理师 宣国华　刘艳丽 (51)Int.Cl. C12N 15/89(2006.01) C12N 15/55(2006.01) C12N 15/113(2010.01) C12N 15/12(2006.01) A01K 67/027(2006.01) C12Q 1/6888(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (56)对比文件 CN 113789352 A,2021.12.14 CN 109402170 A,2019.0 3.01 CN 113817779 A,2021.12.21 CN 10902 2484 A,2018.12.18CN 10419517 7 A,2014.12.10 CN 107974 466 A,2018.0 5.01 CN 114258911 A,2022.04.01 US 202025 3173 A1,2020.08.13 WO 20180 35388 A1,2018.02.2 2 F.S.Abou-Se edo et al.Sex uality, sex change and maturati on patterns in the yellowfin seabream， Acanthopa grus latus （Teleostei: Sparidae） (Hout tuyn, 1782). 《Journal of Ap plied Ichthyol》 .2003,第19卷 (第2期),第6 5-72页 摘要， 材 料与方法， 结果和 讨论部分. Zigang Cao et al.Germl ine Stem Cel ls Drive Ovary Regenerati on in Zebrafish. 《Cell Reports》 .2019,第1709-1717页 摘要， 结 果， 材料与方法部分. 无.ACCESSION NO. XM _037078873， PREDICTED : Acanthopa grus latus nan os homolog 2 (nan os2), mRNA. 《GenBan k》 .2020, FEATURES， ORIGI N. 李明辉.罗非鱼基因敲除技 术的建立及其在 性别决定与分化研究中的应用. 《中国优秀博硕 士学位论文全文数据库 （博士） 农业科技 辑》 .2014,(第10期),第四章. (续) 审查员 陈永强 (54)发明名称 一种利用基因编辑生产1龄 雌性黄鳍鲷的方 法 (57)摘要 本发明公开了一种规模化生产全雌性黄鳍 鲷的方法， 包括以下步骤： （S1） F0代嵌合体雄鱼 的获得； （S2） 测交和基因突变个体的筛选； （S3） 1 龄雌性黄鳍鲷的生产和鉴定。 该方法以黄鳍鲷雌 雄同体生殖特性为基础， 结合性别功能基因 nanos2利用和CRISPR/Cas9基因编辑技术， 为黄鳍鲷养殖提供遗传改良的新品系或新品种。 [转续页] 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图1页 CN 114686524 B 2022.09.30 CN 114686524 B (56)对比文件 潘丽莎等.黄鳝 性逆转过程中G sdf基因cDNA 片段的克隆和表达分析. 《生命科 学研究》 .2017, (第02期), 黄振宇等.Nanos2在雄性生殖系统内的研究 进展. 《中华男科 学杂志》 .2018,(第0 6期), 柳项等.CRIS PR/Cas系统介导的水产生物基 因组编辑研究探索. 《水产学杂志》 .2015,(第0 6期), 马细兰等.黄鳍鲷(Sparus latus)两种生长 激素受体的cDNA克隆及组织表达分析. 《海 洋与 湖沼》 .201 1,(第06期), 梅洁等.鱼类性别异形和性别决定的遗传基 础及其生物技术操控. 《中国科 学:生命科 学》 .2014,(第12期),2/2 页 2[接上页] CN 114686524 B1.一种利用基因编辑 生产1龄雌性黄鳍鲷的方法， 其特 征是包括以下步骤： （S1） F0代嵌合体雄鱼的获得： 利用CRISPR/Cas9基因编辑方法， 采用显微注射 的方式， 将nanos2靶基因的gRNA和Cas9蛋白的mRNA混合物导入黄鳍鲷1细胞期的受精卵的动物极 中， 孵化后即可获得靶基因突变的F0代嵌合体黄鳍鲷雄鱼； （S2） 测交和基因突变个体的筛选： 将步骤 （S1） 中获得的F0代嵌合体黄鳍鲷雄鱼与野生 型雌鱼交配， 从后代中筛 选具有nan os2有义突变的F1代杂合子个 体 （nanos2+/‑） ； （S3） 1龄雌性黄鳍鲷的生产和鉴定： 将F1代杂合子个体 （nanos2+/‑） 养殖到性成熟， 其中 一部分个体正常发育为杂合子雄鱼 （nanos2+/‑） ， 一部分个体自然性逆转为F1代杂合子 雌鱼 （nanos2+/‑） ， 选取F1代杂合子雌鱼 （nanos2+/‑） 和F1代杂合子雄鱼 （nanos2+/‑） 交配， 筛选得 到F2代纯合子突变体个体 （nanos2‑/‑） ， 所述F2代纯合子突变体个体 （nanos2‑/‑） 1龄性成熟 时， 性反转 为功能性雌鱼； 步骤 （S1） 中合成所述nanos2靶基因的gRNA的引物包括正向引物nanos2 ‑gRNA‑F和反向 引物gRNA ‑R， 所述正向引物nano s2‑gRNA‑F的序列如SEQ  ID NO： 1所示， 所述反向引物gRNA ‑ R的序列如SEQ  ID NO： 2所示。 2.根据权利要求1所述利用基因编辑生产1龄雌性黄鳍鲷的方法， 其特征是： 步骤 （S1） 中所述nano s2靶基因的gRNA和所述Cas9蛋白的终浓度分别为30~40 ng/µL和150~200 ng/µ L， 每颗受精卵中所述 nanos2靶基因的gRNA和Cas9蛋白的mRNA混合物的注射 量为1~2nL。 3.根据权利要求1所述利用基因编辑生产1龄雌性黄鳍鲷的方法， 其特征是： 步骤 （S1） 中采用显微注射的方式， 将nanos2靶基因的gRNA和Cas9蛋 白的mRNA混合物导入黄鳍鲷1细 胞期的受精卵的动物极中， 需在受精后40分钟内完成注射。 4.根据权利要求1所述利用基因编辑生产1龄雌性黄鳍鲷的方法， 其特征是： 步骤 （S2） 中将F0代嵌合体黄鳍鲷雄鱼与野生型雌鱼按照1： 1~2的数量配比交配。 5.根据权利要求1所述利用基因编辑生产1龄雌性黄鳍鲷的方法， 其特征是： 步骤 （S2） 中用于检测具有nanos2有义突变的F1代杂合子个体 （nanos2+/‑） 的PCR引物， 包括正向引物 nanos2‑F1和反向引物nanos2 ‑R1， 其中所述正向引物nanos2 ‑F1的序列如SEQ  ID NO： 3所 示， 所述反向引物nan os2‑R1的序列如SEQ  ID NO： 4所示。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114686524 B 3