(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210731626.4 (22)申请日 2022.06.25 (71)申请人 新乡学院 地址 453000 河南省新乡市红旗区金穗大 道东段 (72)发明人 李鹏　王振伟　刘兴友　王利平　 付云龙　原黎伟　梁晓晓　张艳芳　 孙国鹏　岳峰　王选年　安娜　 雷梦瑶　 (74)专利代理 机构 北京慕达星云知识产权代理 事务所 (特殊普通合伙) 11465 专利代理师 田立媛 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01)C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种利用TB Green П qPCR检测PCV3 的方 法 (57)摘要 本发明公开了一种利用TB  GreenПqPCR检 测PCV3的方法， 属于生物技术领域。 本发明公开 的一种利用TB  GreenПqPCR检测PCV3的方法， 通 过比对全基因组序列， 确定PCV3保守区域， 进而 设计特异性引物， 建立TBGreenПqPCR检测方法。 本发明方法敏感性高， 特异性和重复性好， 可在 短时间内完成样品检测， 适用于临床样品中PCV 3 感染的检测， 流行病学监测 和实验室研究等。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图4页 CN 115074465 A 2022.09.20 CN 115074465 A 1.一种以非诊断治疗为目的利用TB  Green П qPCR检测PCV3的特异性引物， 其特征在 于， 所述引物序列如下： PCV3‑RF： 5’ ‑TGCTACGAGTGTC CTGAAGA‑3’； SEQ ID NO.1； PCV3‑RR： 5’ ‑CAATAGATTCCCACTCGGTC‑3’； SEQ ID NO.2。 2.一种以非诊断治疗为目的利用TBGreenПqPCR检测PCV3的方法， 其特征在于， 具体步 骤如下： (1)提取样品DNA， 得到扩增模板； (2)利用权利要求1所述 的特异性引物， 对步骤(1)获得的模板进行TB  Green П qPCR 反应； 所述TB Green П qPCR反应体系如下： 2 ×TB Green Premix Ex Taq П， 10μL； 10μ mol/L PCV3‑RF， 0.5 μL； 10 μmol/L  PCV3‑RR， 0.5 μL； ROX， 0.4 μL； 模板DNA， 1μL； 补加ddH2O至 20 μL； 所述TB Green П qPCR反应条件为： 95℃预变性30s； 95℃变性5s， 64℃退火延伸30s， 40个循环； 熔解温度设为95℃15s， 6 0℃1min， 95℃15s。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115074465 A 2一种利用TB  GreenПqPCR检测PCV3的方 法 技术领域 [0001]本发明涉及生物技术领域， 更具体的说是涉及一种利用TB  GreenПqPCR  检测 PCV3的方法。 背景技术 [0002]猪圆环病毒3型(Porcine  circovirus  3， PCV3)是一种单链环状DNA病毒， 基因组 包含约2000bp核苷酸， 和PCV1、 PCV2、 PCV4同属环状病毒科  (Circoviridae)环状病毒属 (Circovirus)。 PCV 3具有三个主要开放阅读框(Open Rea ding Frames， ORF)， 分别为与病毒 复制相关的ORF1基因、 编码衣壳蛋白的ORF2基因和逃避宿主天然免疫反应相关的ORF3基 因。 该病毒已在世界范围内广泛传播， 美洲、 欧洲和亚洲的数十个国家和地区报道在猪群中 检测到 PCV3存在。 该病毒可引起猪的皮炎和肾病综合征、 心脏和多系统炎症、 母猪繁殖障 碍等猪圆环病毒相关疾病(Porcine  circovirus  associated  diseases，  PCVAD)。 研究显 示， PCV3常和PCV2、 猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)、 猪细小病毒(PPV)等混合感染。 还有 报道指出， 感染PCV3的猪可能不表现出任何临床体征， 使得临床检测难度提高。 因此， 需要 建立一种快速、 灵敏和特异检测PCV3的方法。 [0003]现今尚无用于检测PCV3的国家标准， 仅有山东省和中国兽医协会在2020  年分别 出台了常规PCR和基于T aqMan探针的qPCR方法。 但常规PCR检测灵敏度低； 基于T aqMan探针 的qPCR方法， 需要设计探针， 检测成本高。 [0004]因此， 提供一种利用TB  GreenПqPCR检测PCV3的方法是本领域技术人员亟需解决 的问题。 发明内容 [0005]有鉴于此， 本发明提供了一种利用TB  GreenПqPCR检测P CV3的方法，  TB Green是 荧光定量PCR(qPCR)常用的荧光指示染料， 与DNA双链结合后可发出荧光信号， 同常规PCR相 比灵敏度更高， 操作更加便捷， 同TaqMan  法相比无需设计探针， 检测成本相对更低。 [0006]为了实现上述目的， 本发明采用如下技 术方案： [0007]一种以非诊断治疗为目的利用TB  GreenПqPCR检测PCV3的特异性引物， 所述引物 序列如下： [0008]PCV3‑RF： 5’ ‑TGCTACGAGTGTC CTGAAGA‑3’； SEQ ID NO.1； [0009]PCV3‑RR： 5’ ‑CAATAGATTCCCACTCGGTC‑3’； SEQ ID NO.2。 [0010]进一步， 一种以非诊断治疗为 目的利用TB  GreenПqPCR检测PCV3的方法， 具体步 骤如下： [0011](1)提取样品DNA， 得到扩增模板； [0012](2)利用所述的特异性引物， 对步骤(1)获得的模板进行TB  GreenП qPCR反应； [0013]所述TB GreenПqPCR反应体系如下： 2 ×TB GreenPremixEx  TaqП， 10  μL； 10μ mol/L PCV3‑RF， 0.5 μL； 10 μmol/L  PCV3‑RR， 0.5 μL； ROX， 0.4 μL； 模板DNA， 1μL； 补加ddH2O至说　明　书 1/5 页 3 CN 115074465 A 3