(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210954187.3 (22)申请日 2022.08.10 (66)本国优先权数据 202210909396.6 202 2.07.29 CN (71)申请人 首都医科 大学附属北京胸科医院 地址 101149 北京市通州区北关大街9号院 申请人 杭州圣庭医疗科技有限公司 (72)发明人 逄宇　许佩松　王云飞　谷红仓　 李姗姗　任卫聪　 (74)专利代理 机构 杭州华鼎知识产权代理事务 所(普通合伙) 33217 专利代理师 李晓春 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6895(2018.01)C12Q 1/686(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/32(2006.01) C12R 1/325(2006.01) C12R 1/725(2006.01) C12R 1/72(2006.01) C12R 1/74(2006.01) C12R 1/645(2006.01) C12R 1/68(2006.01) C12R 1/67(2006.01) C12R 1/685(2006.01) C12R 1/66(2006.01) (54)发明名称 一种分枝杆菌和真菌基因特异性引物组及 分枝杆菌和真菌感 染的测序方法 (57)摘要 本发明公开一种分枝杆菌和真菌基因特异 性引物组， 包 括特异性基因IS6100、 hsp65、 rpoB、 gyrA、 L1A1、 RPB1、 Tub2、 CaM、 URA5、 CAP10、 mtLSU、 Kex‑1或MP1引物组。 本发明利用多重PCR技术将 待测病原菌靶基因在一个 反应中进行扩增， 结合 纳米孔测序平台对特异性基因扩增子进行高通 量检测， 可同时检测出6种分枝杆菌和12种真菌 。 权利要求书2页 说明书8页 附图3页 CN 115478114 A 2022.12.16 CN 115478114 A 1.一种分枝杆菌和真菌基因特异性引物组， 其特征是， 包括特异性基因IS6100、 hsp65、 rpoB、 gyrA、 L1A1、 RPB1、 Tub2、 CaM、 URA5、 CAP10、 mtLSU、 Kex ‑1或MP1引物组， 其中， IS6100的 引物序列包含具有SEQ01所示的核苷酸序列和包含具有SEQ02所示的核苷酸序列； 或者 hsp65的引物组包含具有SEQ03所示的核苷酸序列和 包含具有SEQ04所示的核苷酸序列； 或 者rpoB的引物组包含 具有SEQ05所示的核苷 酸序列和包含 具有SEQ06所示的核苷 酸序列； 或 者gyrA的引物组包含 具有SEQ07所示的核苷 酸序列和包含 具有SEQ08所示的核苷 酸序列； 或 者L1A1的引物组包含 具有SEQ09所示的核苷 酸序列和包含 具有SEQ10所示的核苷 酸序列； 或 者RPB1的引物组包含 具有SEQ11所示的核苷 酸序列和包含 具有SEQ12所示的核苷 酸序列； 或 者Tub2的引物组包含 具有SEQ13所示的核苷 酸序列和包含 具有SEQ14所示的核苷 酸序列； 或 者CaM的引物组包含具有SEQ15所示的核苷酸序列和 包含具有SEQ16所示的核苷酸序列； 或 者URA5的引物组包含 具有SEQ17所示的核苷 酸序列和包含 具有SEQ18所示的核苷 酸序列； 或 者CAP10的引物组包含具有SEQ19所示的核苷酸序列和 包含具有SEQ20所示的核苷酸序列； 或者mtLSU的引物组包含具有SEQ21所示的核苷酸序列和包含具有SEQ20所示的核苷酸序 列； 或者Kex ‑1的引物组包含具有SEQ23所示的核苷酸序列和 包含具有SEQ24所示的核苷酸 序列； 或者MP1引物组包含具有SEQ25所示的核苷酸序列和包含具有SEQ26所示的核苷酸序 列。 2.根据权利要求1所述的一种分枝杆菌和真菌基因特异性引物组， 其特征是， 所述分枝 杆菌包括结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌， 所述 非结核分枝杆菌包括： 鸟分枝杆菌、 胞内分 枝杆菌、 龟分枝杆菌、 脓肿分枝杆菌、 堪萨斯分枝杆菌 。 3.根据权利要求1所述的一种分枝杆菌和真菌基因特异性引物组， 其特征是， 所述真菌 包括念珠菌和曲霉菌 。 4.根据权利要求3所述的一种分枝杆菌和真菌基因特异性引物组， 其特征是， 所述念珠 菌包括白色念珠菌、 光滑念珠菌、 热 带念珠菌、 近平 滑念珠菌 。 5.根据权利要求4所述的一种分枝杆菌和真菌基因特异性引物组， 其特征是， 所述曲霉 菌包括烟曲霉、 黄曲霉、 黑曲霉、 土曲霉； 隐球菌包括格特隐球菌、 新型隐球菌、 马尔尼菲蓝 状菌、 耶氏肺 孢子菌。 6.一种分枝杆菌和真菌感染的测序方法， 其特征是， 所述分枝杆菌和真菌感染的测序 方法应用权利要求 1至5任意一项的权利要求所述的分枝杆菌和真菌基因特异 性引物组； 包 括以下步骤： 1)设计覆盖分枝杆菌特异性分型基因IS6100、 hsp65、 rpoB、 gyrA引物； 覆盖念珠菌特异 性分型基因L1A1、 RPB1引物； 2)在各个正向引物 ‑F的5’端加上TTTCTGTTGGTGCTGATATTG碱基填充序列， 各个反向引 物‑R的5’端加上ACTTGCCTGTCGCTCTATCTTC碱基填充序列， 得到含有第二轮PCR引物结合位 点的扩增引物； 3)将第二轮PCR引物结合位点的扩增引物稀释， 混合各基因的正反向引物； 其次将混合 后的引物形成引物池； 4)合成适用于第二轮PCR的Barcode标签引物， 将所有barcode干粉引物稀释， 并将相同 barcode的正反向引物混合， 形成barcode引物池。 7.根据权利要求6所述的利用分枝杆菌和真菌基因特异性引物组以检测分枝杆菌和真权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115478114 A 2菌感染的测序方法， 其特 征是， 还包括步骤5)， 所述 步骤5)为 提取基因 组DNA。 8.根据权利要求6所述的利用分枝杆菌和真菌基因特异性引物组以检测分枝杆菌和真 菌感染的测序方法， 其特征是， 还包括步骤6)， 所述步骤6)为用引物池进 行第一轮扩增并纯 化。 9.根据权利要求6所述的利用分枝杆菌和真菌基因特异性引物组以检测分枝杆菌和真 菌感染的测序方法， 其特征是， 还包括步骤7)， 所述步骤7)为用Barcode引物进行第二轮扩 增并纯化。 10.根据权利要求6所述的利用分枝杆菌和真菌基因特异性引物组以检测分枝杆菌和 真菌感染的测序方法， 其特 征是， 还包括步骤8)， 所述 步骤8)为构建测序文库并纯化。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115478114 A 3