(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210841356.2 (22)申请日 2022.07.18 (71)申请人 百色学院 地址 533000 广西壮 族自治区百色 市中山 二路21号 (72)发明人 杨翠凤　滕峥　刘正鲁　侯宪斌　 (74)专利代理 机构 重庆聚为捷知识产权代理事 务所(普通 合伙) 50297 专利代理师 李闯 (51)Int.Cl. C12Q 1/6858(2018.01) C12Q 1/6895(2018.01) C12N 15/11(2006.01) G16B 20/20(2019.01) G16B 20/30(2019.01)G16B 30/10(2019.01) (54)发明名称 一种凌云牛心李分子鉴定方法 (57)摘要 本发明涉及生物 技术领域， 尤其涉及一种凌 云牛心李分子鉴定方法， 该方法包括以下步骤： (1)基因组DNA提取； ( 2)ITS序列引物合成； (3) ITS序列PCR扩增； (4)ITS序列特异位点 分析； (5) 基于ITS序列的亲缘关系分析。 本发明相比较于 matK及rbcL序列， ITS序列的变异位点更为丰富， 进化速率较快， 遗传差异较大， 更适宜用于凌云 牛心李种间和种内的分子鉴定和亲缘关系分析； 并且还采用DNA分子鉴定技术， 相比于传统的形 态学鉴定方法， 快速有效， 耗时短， 重复性好， 省 时省力效率高， 对于凌云牛心李种质资源的保护 以及优良性状的传承具有重要的现实意 义。 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 CN 115058497 A 2022.09.16 CN 115058497 A 1.一种凌云牛心 李分子鉴定方法， 其特 征在于， 该 方法包括以下步骤： (1)基因组DNA提取； (2)ITS序列引物合成； (3)ITS序列PCR扩增； (4)ITS序列特异位 点分析； (5)基于ITS序列的亲缘关系分析。 2.根据权利要求1所述的一种凌云牛心李分子鉴定方法， 其特征在于， 基因组DNA提取 具体包括以下步骤： (1)采用植物基因 组DNA提取 试剂盒提取叶片总DNA； (2)用分光 光度计和琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量； (3)DNA全部稀释至终质量浓度40mg ·L‑1后置于‑20℃冰箱保存备用。 3.根据权利要求1所述的一种凌云牛心李分子鉴定方法， 其特征在于， ITS序列引物合 成具体为： ITS‑F： 5’ ‑GTAACAAGGTTTCCGTAGG‑3’， ITS‑R： 5’ ‑TCCTCCGCTTATTGATATGC ‑3’。 4.根据权利 要求1所述的一种凌云牛心李分子鉴定方法， 其特征在于， ITS序列PCR扩增 具体包括： PCR扩增反应体系为： 40 μL， 含2 × MasterMix20 μL、 上下游引物(10 μmol ·L‑1) 各1 μL、 DNA模板1 μL、 d dH2O17 μL； PCR扩增反应条件为： 95℃预变性3min； 然后95℃ 变性10s， 55℃退火10s， 72℃延伸45s， 共36个循环； 72℃延伸5mi n； 4℃保存。 5.根据权利要求1所述的一种凌云牛心李分子鉴定方法， 其特征在于， ITS序列特异位 点分析具体包括以下步骤： (1)进行目的片段的回收， 然后将回收的DNA片段连接到pGEM ‑Teasy载体上， 转化至大 肠杆菌DH 5α 感受态细胞； (2)然后涂布于含IPTG、 X ‑gal和Amp的LB固体培 养基上， 37℃培 养过夜， 挑取白斑； (3)通过M13引物PCR扩增检测T ‑easy载体中是否携带有目的片段； (4)最后将含有目的DNA片段的菌液进行序列测定 。 6.根据权利要求1所述的一种凌云牛心李分子鉴定方法， 其特征在于， 基于ITS序列的 亲缘关系分析 具体包括以下步骤： (1)将测序获得的ITS序列在NCBI数据库进行Blast序列比对； (2)用DNAMAN软件进行多重序列比对分析， 并辅以人工校对， 进行序列变异位 点分析； (3)然后用M EGA6.0软件中邻接法(neighbor ‑joining， NJ)构建NJ系统进化 树； (4)得出各种质之间的遗传分歧， 并分析种间和种内的亲缘关系。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115058497 A 2一种凌云牛心李分子鉴定方 法 技术领域 [0001]本发明涉及生物技 术领域， 特别是 涉及一种凌云牛心 李分子鉴定方法。 背景技术 [0002]凌云牛心李是蔷薇科(Rosaceae)李属(Prunus  L.)栽培中 国李(Prunus  salicina   Lindl.)的一个地方优良品种， 产于凌云加尤， 因其果形似牛心而得名。 凌云牛心李口味独 特， 清脆香甜， 风味品质极佳， 是区别于其他李品种的一项重要品质特征， 这也是其属稀缺 果品， 深受消费者喜 爱的原因之一。 凌云牛心李于2015年 获得农产品地理标志保护登记， 是 凌云县重要的特色农业产业。 前期调查研究发现， 由于多年连续种植， 凌云牛心李出现了不 同程度的品种自然退化现象， 加之苗木 市场的混杂， 导致凌云牛心李产业出现产量降低、 品 质下降、 品种不纯正等问题。 因此， 亟需开展凌云牛心李分子鉴定技术及亲缘关系分析， 解 决当前存在的品种 退化、 苗木不纯正、 产量下降、 品质降低等产业共性问题， 对于凌云牛心 李种质资源的保护以及优良性状的传承具有重要的现实意 义。 [0003]DNA条形码(DNAbarcoding)技术以一段标准DNA序列作为标记实现快速、 准确和自 动化的物种鉴定方法， 植物DNA条形码常用的有ITS、 matK、 rbcL和trnH ‑psbA等基因序列， 这 些基因序列除物种鉴定功能外， 还有助于发现新种和隐种。 [0004]当前， 植物DNA条形码技术在部分中国李品种的分子系统发育树构建及亲缘关系 研究方面已有相关研究报道， 如李斌等(2016)采用植物DNA条形码标准序列ITS、 matK及 rbcL对包括槜李在内的22个李品种(或品系)进行PCR扩增、 序列比对及 进化树分析， 获得了 槜李的分子鉴定方法及其亲缘关系， 对于槜李的种质资源保护具有重要意义。 而关于凌云 牛心李的分子鉴定相关研究尚未见报道， 本技术发明拟利用植物DNA条形码标准序列ITS、 matK及rbcL， 对包括9份凌云牛心李在内的13份李种质资源进行序列比对并构建进化树进 行亲缘关系分析， 研究凌云牛心李的分子鉴定方法及其亲缘关系， 旨在对凌云牛心李的种 质资源保护提供技 术支撑。 发明内容 [0005]为实现上述目的， 本发明通过克隆获得了13份李种质资源的核糖体DNA内转录间 隔区ITS序列和叶绿体基因组rbcL和matK基因序列， 经序列差异比对分析， 建立了一种基于 ITS序列快速有效的凌云牛心 李分子鉴定方法。 [0006]本发明提供了一种凌云牛心 李分子鉴定方法， 该 方法包括以下步骤： [0007](1)基因组DNA提取； [0008](2)ITS序列引物合成； [0009](3)ITS序列PCR扩增； [0010](4)ITS序列特异位 点分析； [0011](5)基于ITS序列的亲缘关系分析。 [0012]优选地， 基因 组DNA提取 具体包括以下步骤：说　明　书 1/4 页 3 CN 115058497 A 3