(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210742190.9 (22)申请日 2022.06.28 (71)申请人 中国水产科 学研究院东海水产研究 所 地址 200090 上海市杨 浦区军工路3 00号 (72)发明人 李新苍　王伟　赵姝　王元　 房文红　周俊芳　 (74)专利代理 机构 上海申浩 律师事务所 31280 专利代理师 李阳 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12Q 1/6806(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种养殖水体中青蟹呼肠孤病毒检测试剂 盒及检测方法 (57)摘要 本发明涉及病毒检测领域， 具体是一种养殖 水体中青蟹呼肠孤病毒检测试剂盒及检测方法。 本发明通过 实验比较， 找到了水体中青蟹呼肠孤 病毒富集的最佳方案， 并结合高灵敏性荧光定量 RT‑PCR技术， 建立了针对养殖水体中青蟹呼肠孤 病毒的检测方法。 本发明通过常规超 滤管富集水 体中青蟹呼肠孤病毒， 显著缩短了病毒富集时 间， 提高了病毒的富集效率； 在此基础上利用高 灵敏性荧光定量RT ‑PCR进行病毒检测， 确保了检 测的灵敏性和准确性。 本发明有效的填补了目前 水体中青蟹呼肠孤病毒检测方法的空白， 具有显 著的经济效益和社会效益。 权利要求书1页 说明书9页 序列表2页 附图2页 CN 115305295 A 2022.11.08 CN 115305295 A 1.一种养殖水体中青蟹呼肠孤病毒的检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包含用于 浓缩水体病毒的超滤管， 和高灵敏性荧光定量RT ‑PCR病毒定量检测试剂； 所述的高灵敏性 荧光定量RT ‑PCR病毒定量检测试剂包括一对特异性引物， 上、 下游引物序列分别如SEQ  ID  NO:2和SEQ  ID NO:3所示， 还 包括特异的TaqMan探针， 探针序列如SEQ  ID NO:4所示。 2.根据权利要求1所述的养殖水体中青蟹呼肠孤病 毒的检测试剂 盒， 其特征在于， 所述 超滤管内含有纤维素膜， 所述超滤管纤维素膜截留蛋白的理论分子量为50kDa或大于 50kDa。 3.根据权利要求2所述的养殖水体中青蟹呼肠孤病 毒的检测试剂 盒， 其特征在于， 所述 超滤管以吊篮式离心最高转速为4000g/min， 或以角转子最高转速5000g/min， 浓缩病毒的 最小体积低于10 0 μl。 4.根据权利要求1所述的养殖水体中青蟹呼肠孤病 毒的检测试剂 盒， 其特征在于， 所述 的高灵敏性荧光定量 RT‑PCR病毒定量检测试剂还包括含有适于荧光探针的Taq酶预混试剂 和含随机引物Random6的反转录酶预混试剂， 梯度稀释的标准品质粒， 阳性对照， 阴性对照 (灭菌双蒸水)。 5.根据权利要求4所述的养殖水体中青蟹呼肠孤病 毒的检测试剂 盒， 其特征在于， 所述 的高灵敏性荧光定量RT ‑PCR病毒定量检测试剂的PCR反应体系为： 2 ×Premix Ex Taq (Probe qPCR)10 μL， VP11 ‑F和VP11‑R各0.4 μL(10 μM)， VP11 ‑Probe 0.4 μL(10 μM)， ROX  0.4 μL (根据仪器需要是否加入)， cDNA模板2 μL， d dH2O 6.8 μL， 总反应 体积为20 μl。 6.根据权利要求5所述的养殖水体中青蟹呼肠孤病 毒的检测试剂 盒， 其特征在于， 所述 的高灵敏性荧光定量RT ‑PCR病毒定量检测试剂的PCR反应程序为： 95℃预变性30s； 然后95 ℃变性5s， 6 0℃退火延伸3 0s， 40个循环。 7.一种采用如权利要求1 ‑6任一所述的试剂盒检测养殖水体中青蟹呼肠孤病毒的方 法， 其特征在于， 包 含病毒浓 缩过程和病原检测过程， 具体包括以下步骤： (A)待检测养殖水样需先提前室温静置1小时， 沉淀水体大颗粒， 然后用医用纱布过滤， 滤液以3000r/min离心10mi n取上清； (B)将上清水体连续多次上样， 每管分多次离心， 连续添加， 上样总体积不超过5 0ml； (C)将所述超滤管放置吊篮， 以4000g/min的离心力离心， 或通过角转子以5000g/min速 度离心， 浓 缩液体积大约10 0 μl时停止 离心； (D)用移液器吹悬病毒浓 缩液， 并将其 转移到2ml离心管； (E)按照高灵敏性荧光定量RT ‑PCR病毒定量检测试剂的说明提取浓缩病毒RNA， 检测 RNA质量， 质量 合格RNA样品加入DNase  I， 去除DNA污染； (F)反转录时， 反转录体系除反转录酶、 RNase抑制剂外， 为保证反转录效果， 需加入随 机引物Random6， 置 于42℃水浴3 0min； (G)在配制的荧光定量RT ‑PCR反应体系中， 含有2 ×Premix Ex Taq(Probe  qPCR)10 μL， 引物VP11 ‑F和VP11‑R各0.4μL(10μM)， 探针VP11 ‑Probe 0.4μL(10μM)， ROX  0.4μL(可选)， cDNA模板2 μL(待检测样品核酸、 阳性或阴性对照样品)， d dH2O 6.8 μL， 总反应 体积为20 μl； (H)荧光定量RT ‑PCR的反应条件为： 95℃预变性30s； 然后95℃变性5s， 60℃退火延伸 30s， 40个循环； (I)根据荧光定量RT ‑PCR反应产生的CT值， 确定是否存在病毒感染， 并计算水体病毒含量。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115305295 A 2一种养殖水体中青蟹呼肠孤病毒检测试剂盒及检测方 法 技术领域 [0001]本发明涉及病毒检测领域， 具体地说， 是一种养殖水体中青蟹呼肠孤病毒检测试 剂盒及检测方法。 背景技术 [0002]青蟹呼肠孤病毒(Mud  Crab Reovirus， MCRV)易于传播和流行， 是目前养殖青蟹最 主要的病原之一。 近年来的流行病学研究显示， 该病毒几乎存在于所有青蟹养殖区域， 对青 蟹养殖产业的健康发展 带来了巨大威胁。 该病毒属于无囊膜病毒， 对自然环境耐受 能力强， 青蟹繁殖过程中水体携带该病毒 更容易使其在苗种生产和养殖过程中进 行传播。 我们前期 研究发现MCRV可以在养殖水体中长期存在， 且常规消毒剂杀灭效果有限。 因此， 建立水体中 MCRV检测方法并进行跟踪监测， 对于生产无MCRV 苗种及青蟹养殖产业健康发展都具有指导 意义。 [0003]当前对于养殖用水中MC RV污染问题还没引起足够的重视， 相应的监测体系还没建 立起来。 由于水体中病毒含量远低于组织中病毒含量， 因此很难通过水样直接检测病毒， 必 须对水样中病毒进行富集和浓缩， 这是后续进行病原检测的前提条件。 水体中病毒常以游 离或吸附于水体颗粒形式存在， 抽滤法、 聚乙二醇沉淀法、 超滤管法、 高速离心法及超速离 心法， 是几种常见水体病原 微生物富集的方法。 通过采集含MCRV水样进 行实验和比较， 选择 合适的MCRV富集方法， 对于有效监测水体中的M CRV含量具有重要意 义。 [0004]此外， 随着分子生物学技术的发展， 实时荧光定量技术因其检测靶基因灵敏性高、 反应特异性强、 有较好的重复性及操作污染少等多个优点， 已广泛应用于不同类型病毒的 检测。 发明内容 [0005]本发明的目的在于提供一种养殖水体中青蟹呼肠孤病毒检测试剂盒及检测方法。 在充分富集病毒的基础上， 结合实时荧光定量RT ‑PCR技术， 建立青蟹养殖和 繁育过程中水 体MCRV检测技 术， 可为M CRV预防和控制， 乃至青蟹苗种M CRV净化提供必要的技 术支撑。 [0006]为了实现上述目的， 本发明采用以下技 术方案： [0007]本发明通过实验比较， 找到了水体中MCRV富集的最佳方案， 并结合高灵敏性荧光 定量RT‑PCR技术， 建立了针对养殖水体中青蟹 呼肠孤病毒的检测方法。 该方法通过常规超 滤管富集水体中MCRV， 显著缩短了病毒富集时间， 提高了病毒的富集效率； 在此基础上利用 高灵敏性荧光定量RT ‑PCR进行病毒检测， 确保了检测的灵敏性和准确性。 本发明有效的填 补了目前 水体中MCRV检测方法的空白， 具有显著的经济效益和社会效益。 [0008]本发明的第一方面， 提供一种养殖水体中青蟹呼肠孤病毒的检测试剂盒， 所述试 剂盒包含用于浓 缩水体病毒的超滤 管， 和高灵敏性 荧光定量RT ‑PCR病毒定量检测试剂。 [0009]其中， 所述超滤管为商品化常规实验耗材， 不同品牌产品预计有类似过滤效果。 本 发明为方便操作， 选择最常见的Millipore密理博50kDa超滤离心管， 单次上样体积可达说　明　书 1/9 页 3 CN 115305295 A 3