(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210932113.X (22)申请日 2022.08.04 (71)申请人 云南省烟草农业科 学研究院 地址 650000 云南省昆明市五华区 圆通街 33号 (72)发明人 盖晓彤　冯智宇　姜宁　卢灿华　 夏振远　韩天华　户艳霞　代快　 杨海林　王继明　 (74)专利代理 机构 成都市鼎宏恒业知识产权代 理事务所(特殊普通合伙) 51248 专利代理师 张勋 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/77(2006.01) (54)发明名称 一种共享镰刀菌的检测方法及其应用 (57)摘要 本发明涉及一种共享镰刀菌的检测方法及 其应用， 所述的检测方法包括特异性引物组： Fc ‑ geno‑1F/Fc‑geno‑1R。 本发明有益效果为， 1、 现 有技术中没有针对PCR检测烟草镰刀菌根腐病病 原菌共享镰刀菌的特异性引物， 本发 明实现了零 的突破； 2、 本发明研究筛选 出的引物具有极高的 准确度和特异性； 3、 综合使用本发明的方法， 其 最大灵敏度可达1.0ng/μL； 4、 本发明的应用在 于检测疑似被共享镰刀菌侵染的烟株最小时间 为12小时； 5、 本发明能在接种共享镰刀菌后早期 检测到病原菌， 达到烟草镰刀菌根腐病早期检测 的目的， 对于烟草镰刀菌根腐病的早期检测， 预 防和控制具有非常重要的意义和重大的经济意 义。 权利要求书2页 说明书6页 附图3页 CN 115161412 A 2022.10.11 CN 115161412 A 1.一种共享镰刀菌的检测方法， 其特 征在于， 所述的检测方法包括特异性引物组： 正向引物Fc ‑geno‑1F： 5′ ‑TACAAGAGCTTAATGAGATTGC‑3′； 反向引物Fc ‑geno‑1R： 5′ ‑CTCCTCCGTTGTTGGTGATT‑3′。 2.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 所述的特异性引物组Fc ‑geno‑1F/Fc‑ geno‑1R对应的扩展片段大小为440bp； 序列 为TACAAGAGCTTAATGAGATTGCGGAGAAGTACTCACG CTCCCGTAA GGCCCACGATCCGAA GCGATACACGGATAA GGTCAAATGGTTCTCCGATGCAA GCAAGATCGAAGAG CTTCAAGAAA GAGCCCAGGCTACTAA GTCCAATCTTCACATGGCCATCACCTTTA GGGTTTCTTCTATGGTA GATA GGGGAAATGTGCGACA GGAAGTGAGTTCTCAGGGTGTCGTCTGTTGTCTAAACTGACACGTTGACGGTCTCTTTCA CCGCGTGGCACAACA GTTGACTTACTATACGCAAAA GACTCATAATATCTCTCAAACATTACCCAA GTTACTCCAA GGACCACACCCCAA GCCAGAAAATTCAACCGCAA GCCTACAACCCGCGACTGAA GGCACAACGATTCACCACAA GC CCGAATCACCAACAACGGAGGAG。 3.根据权利要求2所述共享镰刀 菌的检测方法， 其特征在于， 所述的检测方法包括以下 步骤： S1： 提取待检测样品DNA； S2： 以待测样品为DNA为模板， 采用一对引物进行PCR扩增； S3： 扩增产物琼脂糖凝胶电泳分析。 4.根据权利要求3所述共享镰刀菌的检测方法， 其特征在于， 所述步骤S1中提待检测样 品DNA的具体步骤如下： S11： 称取待检测样品0.1g左右， 加液氮在研钵中用研磨棒研磨成细末， 将细末转移至 离心管中， 加入600 μL预热至65℃的CTAB提取液， 颠倒混匀， 65℃水浴30～60min； 所述步骤 S11中的CTAB提取 液含2％巯基乙醇； S12： 取出离心管冷却至室温， 加入600μL氯仿： 异戊醇溶液， 振荡混匀， 12000rpm离心 15min， 取400 μL上清液移至 离心管中； 所述 步骤S12中的氯仿： 异戊醇体积比为24:1； S13： 取上清液离心管中， 加入等倍体积的预冷的异丙醇， 轻轻颠倒混匀， ‑20℃放置 30min以上， 120 00rpm离心10mi n； S14： 去掉上清液， 加入70％无 水乙醇清洗1次， 120 00rpm离心10mi n； S15： 去掉上清液， 加入95％无水 乙醇再清洗1次， 12000rpm离心5min， 室温干燥后用适 量无菌ddH2O溶解沉淀的DNA， ‑20℃保存备用。 5.根据权利要求3所述共享镰刀菌的检测方法， 其特征在于， 所述步骤S2中PCR扩增的 反应体系总体积为2 5 μL， 包括10×Taq PCR buffer 2.5 μL， 2.0 μL  dNTP各0.25mmol/L， 1.0U   Taq聚合酶5U/ μL， 1.0 μL上 下游引物5 ×10‑3mmol/L， 1 μL模板DNA， 无菌d dH2O补足至25 μL。 6.根据权利要求3所述共享镰刀菌的检测方法， 其特征在于， 所述步骤S2中PCR扩增程 序为： 94℃预变性3min， 94℃变性1min， 55℃退火30s， 72℃延伸30s， 30个循环， 72℃延伸 7min。 7.根据权利要求3所述共享镰刀菌的检测方法， 其特征在于， 所述步骤S3 中琼脂糖凝胶 电泳采用1％的琼脂糖凝胶， 采用13 0V恒压电泳25mi n。 8.权利要求1或2所述检测方法在于烟草镰刀 菌根腐病的早期检测、 预防和控制中的应 用。 9.根据权利要求8所述的应用， 其特 征在于， 检测共享镰刀菌的灵敏度为1.0ng/ μL。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115161412 A 210.根据权利要求8所述的应用， 其特征在于， 检测疑似被共享镰刀菌侵染的烟株最小 时间为12小时。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115161412 A 3