(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210579625.2 (22)申请日 2022.05.25 (71)申请人 郑州大学第一附属医院 地址 450000 河南省郑州市二七区建 设东 路1号 (72)发明人 吴鹏　刘章锁　毛子慧　高钟秀子 　 霍金玲　魏起超　周蕊　李明艳　 包秀豪　 (74)专利代理 机构 郑州翊博专利代理事务所 (普通合伙) 41155 专利代理师 周玉青 (51)Int.Cl. C12N 15/89(2006.01) C12N 15/85(2006.01) C12N 15/113(2010.01)C12N 9/16(2006.01) A01K 67/027(2006.01) C12Q 1/6888(2018.01) C12N 15/11(2006.01) A61K 49/00(2006.01) (54)发明名称 一种全身诱导性Ppp3ca基因敲除鼠模型的 构建方法 (57)摘要 本发明属于生物 技术领域， 公开了一种全身 诱导性Ppp3ca基因敲除鼠模型的构建方法， 步骤 为： 1） 将sgRNA、 Cas9  mRNA及同源重组载体注入 鼠受精卵中； 2） 将受精卵移植到假孕母鼠体内， 产出F0代鼠， 筛选阳性F0代鼠； 3） 将阳性F0代鼠 与野生型鼠交配， 获得F1代杂合子鼠， 筛选阳性 F1代杂合子鼠； 3） 将阳性F 1代杂合子鼠与特异性 Cre工具鼠交配， 得到Ppp3caFlox/+ Cre+鼠和 Ppp3caFlox/+ Cre‑鼠， 将Ppp3caFlox/+ Cre+鼠与 Ppp3caFlox/+ Cre‑鼠进行兄妹配繁， 获得 Ppp3caFlox/Flox Cre+纯合子鼠。 本发明实现了 Ppp3ca基因时间特异性的全身 性诱导敲除， 为有 目的的研究Ppp3ca基因在不同组织器官中的作 用提供理想的动物模型。 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图2页 CN 115044619 A 2022.09.13 CN 115044619 A 1.一种全身诱导性Ppp3ca基因敲除鼠模型的构 建方法， 包括采用Cre/loxP系统特异性 敲除鼠基因 组中的第3 外显子。 2.根据权利 要求1所述的构 建方法， 其特征在于， 所述全身诱导性Ppp3ca基因敲除鼠模 型的构建方法包括以下步骤： (1)将sgRNA、 Cas9  mRNA及同源重组载体注入鼠受精卵中； (2)将经步骤(1)处理后的受精卵移植到假孕母鼠体内， 待产出F0代鼠， 对产出的F0代 鼠进行鉴定， 筛 选出阳性F0代鼠； (3)将阳性F0代鼠与野生型鼠交配， 获得F1代杂合子鼠， 对F1代杂合子鼠进行鉴定， 筛 选出阳性F1代杂合子鼠； (4)将阳性F1代杂合子鼠与特异性Cre工具鼠交配， 得到Ppp3caFlox/+Cre+鼠和 Ppp3caFlox/+Cre‑鼠， 将Ppp3caFlox/+Cre+鼠与Ppp3caFlox/+Cre‑鼠进行兄妹配繁， 获得 Ppp3caFlox/Flox Cre+纯合子鼠， 即为全身诱导性Ppp3c a基因敲除鼠模型； 其中， 所述同源重 组载体是对Ppp3ca基因的第三外显子进行Flox修饰， Flox与特异性的Cre结合后， 能够条件 性敲除Ppp3ca基因的第3 外显子。 3.根据权利要求1所述的构建方法， 其特征在于， 所述sgRNA为特异性靶向Ppp3ca基因 的sgRNA， 所述sgRNA由sgRNA ‑1和sgRNA ‑2组成或由sgRNA ‑3和sgRNA ‑4， sgRNA‑1、 sgRNA‑2、 sgRNA‑3和sgRNA ‑4的核苷酸序列如下： sgRNA‑1： 5’ ‑GCTAAAGTGGAATGTCGGGAAGG‑3’(SEQ ID NO.1)； sgRNA‑2： 5’ ‑TTTTCCTACTCTATA AGTGCTGG‑3’(SEQ ID NO.2)； sgRNA‑3： 5’ ‑AGAGGCTAAAGTGGAATGTCGGG‑3’(SEQ ID NO.3)； sgRNA‑4： 5’ ‑GGTGCCTAATATAATGTCTCAG G‑3’(SEQ ID NO.4)。 4.根据权利要求3所述的构建方法， 其特征在于， 所述Cre工具鼠为CAGGCre ‑ERTM工具 鼠。 5.根据权利 要求1‑4任一所述的构 建方法， 其特征在于， 步骤(2)和步骤(3)中所述鉴定 为PCR鉴定， PCR鉴定采用的特异性引物包括： Ppp3ca‑F1： 5’ ‑AATTGACTCTTGCTAAAGGGAGGG‑3’(SEQ ID NO.5)； Ppp3ca‑R1： 5’ ‑TCCACCATGAACAGATAATGGCTA‑3’(SEQ ID NO.6)； CAGGCre‑ERTM‑F1： 5’ ‑GCTAACCATGTTCATGCCTTC‑3’(SEQ ID NO.7)； CAGGCre‑ERTM‑R1： 5’ ‑AGGCAAATTTTGGTGTACGG‑3’(SEQ ID NO.8)。 6.利用权利 要求1‑5任一所述构建方法构建的全身诱导性Ppp3ca基因敲除鼠模型在筛 选钙调神经磷酸酶抑制剂作用靶点中的应用。 7.利用权利 要求1‑5任一所述构建方法构建的全身诱导性Ppp3ca基因敲除鼠模型在研 究CNI诱发不良反应机制中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115044619 A 2一种全身诱导性Pp p3ca基因敲除 鼠模型的构建 方法 技术领域 [0001]本发明涉及生物技术领域， 具体涉及一种全身诱导性Ppp3ca基因敲除鼠模型的构 建方法。 背景技术 [0002]钙调神经磷酸酶抑制剂(Calcineurin  inhibitor， CNI)是临床常用的免疫抑制药 物， 通常用于预防移植后的排斥反应， 也用于治疗自身免疫性疾病， 包括环孢素和他克莫 司。 它们通过与各自的细胞内免疫亲和蛋白(即亲环 蛋白和FK结合蛋白12)结合， 形成CNI ‑ 免疫亲和蛋白复合物， 此复合物随后结合并抑制钙调神经磷酸 酶(Calcineurin， CN)的去磷 酸化作用， 损害活化T细胞核因子(Nuclear  Factor of Activated  T Cell， NFAT)的核转位 以及下游靶基因白细胞介素2的转录， 最 终损害T细胞的活化和增殖， 从而引起免疫抑制。 然 而， 临床上应用CNI治疗的同时也会引起诸多不良反应， 包括高血压、 高钾血症、 代谢性酸中 毒和高钙尿症等， 随着移 植患者数量的不断增加， CNI所导致的不良反应也受到越来越多的 关注。 因此， 深入研究CN I诱发不良反应的机制具有十分重要的临床意 义。 [0003]钙调神经磷酸酶是一种钙离子和钙调蛋白依赖性丝氨酸/苏氨酸磷酸酶， 也称为 蛋白磷酸酶3。 CN由2个亚基钙调神经磷酸酶A和B 组成， 亚基A是结合钙调蛋白的催化亚基， 由α、 β 、 γ三个亚型构成， 亚基B是结合钙 离子的调节 亚基， 由α、 β 两个亚型构成。 CN存在于大 多数细胞类型中， 主要在机体免疫应答中发挥作用， 当抗原 提呈细胞与T细胞 受体相互作用 时， 细胞内钙 离子增加， 从而激活CN， CN能够 去磷酸化NFAT， 使其转移到细胞核中， 进而增加 IL‑2、 IL‑3、 IL‑4以及TNF ‑α 等早期细胞因子基因转录 激活， 刺激白细胞增值分化。 [0004]Ppp3ca是钙调神经磷酸酶催化亚基A的一种亚型， 位于小鼠3号染色体， 含14个外 显子， 在发育过程中至关重要， Ppp3ca基因主要表达于肾脏皮质 、 大脑额叶、 小脑及中枢神 经系统， Ppp3ca基因的缺失可导致肾脏和神经系统发育缺陷。 Ppp3ca‑/‑小鼠没有免疫受损， 尽管NFAT下游靶点白细胞介素 ‑2的循环水平略低， 但T细胞和B细胞的发育不受影响， 成熟 淋巴细胞的功能仅轻度改变， 但是Ppp3ca‑/‑小鼠表现出出生后肾脏发育缺陷和慢 性肾功能 衰竭， 大多数在21至28天之间死亡， 因此， 无法用于研究Ppp3ca基因的作用机制及Ppp3ca对 成年小鼠肾脏表型等。 发明内容 [0005]针对现有技术中存在的问题和不足， 本发明的目的旨在提供一种全身诱导性 Ppp3ca基因敲除鼠模型的构建方法。 [0006]为实现发明目的， 本发明采用的技 术方案如下： [0007]本发明第一方面提供了一种全身诱导性Ppp3ca基因敲除鼠模型的构建方法， 包括 采用Cre/l oxP系统特异性 敲除鼠基因 组中的第3 外显子。 [0008]根据上述的构建方法， 优选地， 所述全身诱导性Ppp3ca基因敲除鼠模型的构建方 法包括以下步骤：说　明　书 1/5 页 3 CN 115044619 A 3