(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210705662.3 (22)申请日 2022.06.21 (71)申请人 广东一方制药有限公司 地址 528000 广东省佛山市南海区里 水镇 旗峰工业 开发区 (72)发明人 胡绮萍　钟春琳　谭斯尹　黄上书　 刘潇晗　罗宇琴　魏梅　陈向东　 (74)专利代理 机构 广州三环 专利商标代理有限 公司 44202 专利代理师 李素兰 (51)Int.Cl. C12Q 1/6876(2018.01) C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/686(2018.01)C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种僵蚕及其饮片、 水提物制品和配方颗粒 特异性PCR鉴别方法及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种用于僵蚕和/或炒僵蚕及 其饮片、 水提物制品和配方颗粒特异性PCR鉴别 的引物， 其包括第一引物对和第二引物对； 其中， 所述第一引物对的上游引物的序列如SEQ  ID  NO： 1所示， 其下游引物的序列如SEQ  ID NO： 2所 示； 所述第二引物对的上游引物的序列如SEQ  ID  NO： 3所示， 其下游引物的序列如SEQ  ID NO： 4所 示。 本发明还公开了上述引物的应用， 基于该引 物的试剂盒以及基于该引物的鉴别方法。 实施本 发明， 可有效鉴别僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、 水 提物制品和配方颗粒的真伪。 权利要求书2页 说明书13页 序列表1页 附图9页 CN 115261452 A 2022.11.01 CN 115261452 A 1.一种用于僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、 水提物制品和配方颗粒特异性PCR鉴别的引 物， 其特征在于， 包括第一引物对和第二引物对； 其中， 所述第一引物对的上游引物的序列如SEQ  ID NO： 1所示， 其下游引物的序列如 SEQ ID NO： 2所示； 所述第二引物对的上游引物的序列如SEQ  ID NO： 3所示， 其下游引物的序列如SEQ  ID  NO： 4所示。 2.如权利要求1所述的引物在(1)、 (2)或(3)中的应用： (1)鉴定僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、 水提物制品和配方颗粒真伪的应用； (2)制备用于鉴别僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、 水提物制品和配方颗粒的试剂盒； (3)构建快速鉴别僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、 水提物制品和配方颗粒真伪的鉴定方法 中的应用。 3.根据权利要求2所述的鉴定僵蚕和/或炒 僵蚕及其饮片、 水提物制品和配方颗粒真伪 的应用， 其特征在于， 所述应用为鉴定僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、 水提物制品和配方颗粒 是否来源于家蚕和白僵 菌。 4.一种试剂盒， 其特 征在于， 其包括如权利要求1所述的引物。 5.一种快速鉴别 僵蚕和/或炒 僵蚕及其饮片、 水提物制品和配方颗粒真伪的鉴定方法， 其特征在于， 包括以下步骤： S1、 提取待测样品的基因 组DNA； S2、 以所述基因组DNA为模板， 采用如权利要求1所述的引物进行PCR扩增， 得到扩增产 物； S3、 将所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析， 以判断待测样品的真伪。 6.如权利要求5所述的快速鉴别僵蚕和/或炒 僵蚕及其饮片、 水提物制品和配方颗粒真 伪的鉴定方法， 其特 征在于， 步骤S1中， 采用如下 方法提取待测样品的基因 组DNA： 取待测样品， 加入CTAB沉淀液沉淀提取1～3次； 取沉淀物加入CTAB提取液、 蛋白酶K、 β ‑ 巯基乙醇提取， 然后加入氯仿 ‑异戊醇萃取1～3次； 取萃 取后上清液， 加入异丙醇或异丙醇 ‑ 乙酸钠沉淀提取， 沉淀物经洗涤、 孵 育后用水 溶解， 即得待测样品的基因 组DNA。 7.如权利要求5所述的快速鉴别僵蚕和/或炒 僵蚕及其饮片、 水提物制品和配方颗粒真 伪的鉴定方法， 其特 征在于， 步骤S2中包括： 以所述基因 组DNA为模板， 采用所述第一引物对进行第一PCR扩增， 得到第一扩增产物； 以所述基因 组DNA为模板， 采用所述第二引物对进行第二PCR扩增， 得到第二扩增产物。 8.如权利要求5所述的快速鉴别僵蚕和/或炒 僵蚕及其饮片、 水提物制品和配方颗粒真 伪的鉴定方法， 其特征在于， 步骤S2中， 所述P CR扩增的程序为： 将扩增体系在94～96℃的温 度下预变性4～6min， 然后在预设程序下循环 29～40次， 最后在71～75℃延伸4～6mi n； 其中， 所述预设程序为： 先在94～96℃的温度下变性20～40s， 随后在50～70℃的温度 下退火20～40s， 再在6 5～80℃的温度下延伸20～40s。 9.如权利要求7所述的快速鉴别僵蚕和/或炒 僵蚕及其饮片、 水提物制品和配方颗粒真 伪的鉴定方法， 其特征在于， 所述第一PCR扩增的反应体系为： 2 ×M5 Supper FastTaq PCR  MasterMix  12.5 μL， 所述第一引物对的上游引物0.3 μL， 所述第一引物对的下游引物0.3 μL， DNA模板2 μL， 灭菌双蒸水补足至25 μL；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115261452 A 2所述第二PCR扩增的反应体系 为： 2×M5 Supper FastTaq PCR MasterMix  12.5 μL， 所 述第二引物对的上游引物0.3 μL， 所述第二引物对的下游引物0.3 μL， DNA模板1 μL， 灭菌双蒸 水补足至25 μL。 10.如权利要求7所述的快速鉴别僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、 水提物制品和配方颗粒 真伪的鉴定方法， 其特 征在于， 步骤S3中包括： 将所述第一扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析， 若所述第一扩增产物在152bp处产生 条带， 则待测样品中含有家蚕； 将所述第二扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析， 若所述第二扩增产物在260bp处产生 条带， 则待测样品中含白僵 菌； 所述待测样品中同时含有家蚕和白僵菌时， 所述待测样品为真品； 否则待测样品为伪 劣品。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115261452 A 3