(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210779034.X (22)申请日 2022.06.30 (71)申请人 华中科技大 学协和深圳医院 地址 518000 广东省深圳市南 山区桃园路 89号 (72)发明人 张倩　钱卫东　王雪飞　李永东　 王婷　陈思　李菲　柴宝　陈宏翔　 (74)专利代理 机构 北京三聚阳光知识产权代理 有限公司 1 1250 专利代理师 张均莹 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种人博卡病毒1型核酸快速检测试剂盒及 方法和用途 (57)摘要 本发明提供的一种人博卡病毒1型核酸快速 检测试剂盒， 本发明通过利用RAA技术结合 CRISPR/Cas12a检测体系联合， 基于RAA的靶向 DNA特异性放大体系， 以及CRISPR/Cas12a ‑crRNA 复合物结合RAA制备的靶标DNA， 激活Cas12a蛋白 的无差别的反式DNA切割活性， 对ssDNA报告分子 的反式切割， ssDNA报告分子被切开后产生荧光 信号， 进而实现对人博卡病毒1型核酸的高灵敏 度、 高特异性的快速检测， 具有 耗时短、 操作简单 且不依赖大 型实验设备等优势。 权利要求书2页 说明书8页 序列表2页 附图2页 CN 115537472 A 2022.12.30 CN 115537472 A 1.一种人博卡病毒1型核酸快速检测试剂盒， 其特征在于， 包括独立包装的RAA体系和 CRISPR/Cas12a检测体系； 所述RAA体系中包括基于人博卡病毒1型核酸设计的RAA引物对， 所述RAA引物对包括正 向引物和反向引物， 所述正向引物的核苷 酸序列如SEQ  ID NO.1所示， 所述反向引物的核苷 酸序列如SEQ  ID NO.2所示； 所述CRISPR/Cas12a检测体系中包括的基于人博卡病毒1型核酸设计的crRNA， 所述 crRNA的核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示。 2.根据权利要求1所述的人博卡病 毒1型核酸快速检测试剂 盒， 其特征在于， 所述RAA体 系中还包括无核酸酶水、 缓冲液和/或镁离 子。 3.根据权利要求2所述的人博卡病 毒1型核酸快速检测试剂 盒， 其特征在于， 所述RAA体 系中包括： 正向引物， 浓度10 μM， 体积1 μL； 反向引物， 浓度10 μM， 体积1 μL； 2×缓冲液， 体积25 μL； 镁离子， 浓度280mM ‑300mM， 体积2 ‑3 μL； 无核酸酶水， 体积13.5 μL ‑14.5 μL。 4.根据权利要求1 ‑3任一项所述的人博卡病毒1型核酸快速检测试剂盒， 其特征在于， 制备所述crRNA的寡DNA单链序列组包括crRNA1寡DNA单链序列组或crRNA2寡DNA单链序列 组； 所述crRNA1寡DNA单链序列组包括crRNA1 ‑F和crRNA1 ‑R， crRNA1 ‑F的核苷酸序列如SEQ   ID NO.4所示， crRNA1 ‑R核苷酸序列如SEQ  ID NO.5所示； 所述crRNA2DNA单链序列组包括 crRNA2‑F和crRNA2 ‑R， 所述crRNA2 ‑F核苷酸序列如SEQ  ID NO.6所示， 所述crRNA2 ‑R核苷酸 序列如SEQ  ID NO.7所示； 可选的， 所述CRISPR/Cas12a检测体系中还包括Cas12a蛋白、 ssDNA报告分子、 缓冲液 和/或无核酸酶水； 可选的， s sDNA报告分子为5 ’ ‑F‑TTATTATT‑Q‑3’， 所述F为 荧光素， Q为荧光淬灭剂； 可选的， F为6 ‑羧基荧光素， Q为荧光淬灭剂BHQ1； 可选的， 所述缓冲液为 NEB 2.1缓冲液。 5.根据权利要求4所述的人博卡病毒1型核酸快速检测试剂盒， 其特征在于， 所述 CRISPR/Cas12a检测体系中包括： NEB 2.1缓冲液， 5 μL； crRNA， 50‑200 μM， 2.5‑10 μL； ssDNA报告分子， 1 ‑2 μM， 2 μL； Cas12a蛋白， 1‑2 μM， 1‑2 μL； 无核酸酶水， 26 ‑32 μL； 可选的， 所述CRIS PR/Cas12a检测体系中包括： NEB 2.1缓冲液， 5 μL； crRNA， 10 0 μM， 5 μL； ssDNA报告分子， 1 μM， 2 μL； Cas12a蛋白， 1 μM， 1 μL；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115537472 A 2无核酸酶水， 32 μL。 6.权利要求1 ‑5任一项所述的人博卡病毒1型核酸快速检测试剂盒在制备检测人博卡 病毒1型核酸的产品中的用途。 7.一种利用权利要求1 ‑5任一项所述的人博卡病毒1型核酸快速检测试剂盒非疾病诊 断的检测人 博卡病毒1型核酸的方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： S1、 将待测样品DNA加入RA A体系中进行RA A等温扩增， 得到RA A扩增产物； S2、 将RAA扩增产物加入CRIS PR/Cas12a检测体系中进行反应； S3、 实时检测S2中CRISPR/Cas12a检测体系荧光变化， 绘制荧光曲线； 所绘制 荧光曲线 中， 将随时间延长荧光值呈曲线上升的检测结果判定为阳性； 将随时间延长荧光值呈水平 线的结果判定为阴性； 或 将免疫胶体金试纸条插入到S2中反应后的CRISPR/Cas12a检测体系中， 在5min内即出 现控制线和检测线两条条带的检测结果判定为阳性； 5 min内仅在 控制线处出现条带的结果 判定为阴性。 8.根据权利要求7所述的检测人博卡病 毒1型核酸的方法， 其特征在于， 所述S1步骤中， RAA等温扩增条件为： 37 ‑40℃反应20 ‑30min； 可选的， RA A等温扩增条件为： 37℃反应20mi n。 9.根据权利要求7或8所述的检测人博卡病 毒1型核酸的方法， 其特征在于， 所述S2步骤 中， 所述反应条件为： 37 ‑40℃反应20 ‑30min； 可选的， 所述反应条件为： 37℃反应3 0min。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115537472 A 3