(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210640815.0 (22)申请日 2022.06.07 (71)申请人 兰州大学 地址 730000 甘肃省兰州市城关区天水南 路222号 (72)发明人 王维民　张德印　李发弟　张小雪　 李晓龙　赵源　张煜坤　 (74)专利代理 机构 北京智为时代知识产权代理 事务所(普通 合伙) 11498 专利代理师 王加岭　杨静 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种与绵羊免疫性状相关的分子标记、 其检 测方法和应用 (57)摘要 本发明提供了一种与绵羊免疫性状相关的 分子标记、 检测方法及其应用。 所述分子标记根 据IL18基因序列设计引物， 从绵羊血液中提取 DNA， 通过PCR扩增、 DNA测序和序列分析， 发现再 扩增片段的第381位存在一个A /G多态性位点， 进 一步使用KASPar引物对79 0只湖羊的多态性位点 进行检测和建立最小二乘模型， 对基因型与免疫 性状指标进行关联分析， 发现该位点与绵羊的红 细胞计数、 红细胞平均体积和平均红细胞血红蛋 白浓度呈显著相关。 通过检测本发明的分子标 记， 可用于绵羊的标记辅助育种上， 加速绵羊育 种进程。 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图2页 CN 115478111 A 2022.12.16 CN 115478111 A 1.一种与绵羊免疫性状相关的分子标记， 其特征在于， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所 示， 其第381bp处的R表示A或G， 该突变导 致分子标记的A/G多态性。 2.一种检测权利要求1所述的分子标记的PCR引物对， 其特征在于， 其包括正向引物和 反向引物， 其中， 正向引物的序列如SEQ  ID NO.2所示， 反向引物的序列如SEQ  ID NO.3所 示。 3.一种检测权利要求1所述的分子标记的KASPar引物对， 其特征在于， 其包括核苷酸序 列如SEQ ID NO.4、 SEQ ID NO.5和SEQ  ID NO.6所示的序列。 4.一种检测权利要求1所述的分子标记的试剂盒， 其特征在于， 其包含权利要求2所述 的PCR引物对或/和权利要求3所述的KAS Par引物对。 5.一种检测权利要求1所述的分子标记的方法， 其包括如下步骤： a)使用权利要求2所述的PCR引 物对或权利要求3所述的KASPar引 物对， 或者使用权利 要求4所述的试剂盒， 对绵羊全血基因 组DNA进行扩增； b)对步骤a)获得扩增产物的多态性 位点进行分型鉴定 。 6.根据权利 要求5所述的方法， 其特征在于， 步骤b)中的分型鉴定方法为测序法和KASP 基因分型技 术。 7.根据权利要求5所述的方法， 其特征在于， 利用权利要求3所述的KASPar引物对进行 PCR扩增， 扩增结束后， 再通过检测荧 光信号确定分型 结果。 8.权利要求1所述的分子标记或权利要求2所述的PCR引物对或权利要求3所述的 KASPar引物对， 或权利要求4所述的试剂盒， 或权利要求5 ‑7任一项所述的方法在绵羊免疫 性状相关检测中的应用。 9.权利要求1所述的分子标记或权利要求2所述的PCR引物对或权利要求3所述的 KASPar引物对， 或权利要求4所述的试剂盒， 或权利要求5 ‑7任一项所述的方法在绵羊育种 中的应用。 10.根据权利要求9所述的应用， 其特征在于， 其育种目的是为挑选出免疫性状较好的 绵羊品种。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115478111 A 2一种与绵羊免疫性状相关的分子标记、 其检测方 法和应用 技术领域 [0001]本发明属于绵羊分子标记筛选与制备技术领域， 具体涉及IL18基因多态  性作为 影响绵羊免疫性状的分子标记、 其检测方法和应用。 背景技术 [0002]在养羊生产中， 疾病严重影响羊只的健康以及企业或养殖户的经济效益。  尽管通 过加强饲养管理、 改善环境卫生和实施严格的免疫程序等措施可预防  疾病， 但不能有效的 控制传染病的流行， 同时 随着生活水平的提高以及人们  消费观念的转变， 营养、 绿色、 健康 的食品已逐渐成为行业 发展的主向标，  使得减少疫苗和药物使用的呼声越来越高。 因此筛 选与免疫性状相关的分子  标记， 从遗传角度提高羊只对病原的抗性， 增强其免疫力是从根 本上解决这  一问题的有效手段。 随着分子生物学技术的发展， 分子标记辅助选择   (marker‑assisted selection,MAS)被广泛应用于畜禽的选种选 育工作中。 [0003]绵羊作为主要的草食动物， 其抗病育种工作也越来越被重视， 目前已鉴  定出的主 要抗病候选基因有： 绵羊天然抗性巨噬结合蛋白1(Natural resistance ‑associated   macrophage  protein 1， Nramp1)基因多态性与伤寒沙门  氏菌易感性和抗性有关(姚菊霞， 王光华， 马利青.羊主要抗病候选基因的  研究进展.青海畜牧兽医杂志， 2014,44(5)： 40～ 43.)绵羊的主要组织相  容性复合体(Major  Histocompatibility  Complex,MHC)， 又称为 绵羊白细胞抗  原(Ovine  Lymphocyte  Antigen， OLA)其结构与牛的MHC(BoLA)相似，  具有 高度的多态性和连锁不平衡， 其多态 性和遗传性对保护其机体组织对抗  疾病， 引起机体免 疫应答具有重要作用(冉晓炜.OLA基因在绵羊抗病育种  中的研究进展[J].科技视界， 2015 (12):291～303.)。 此外其它有研究的与抗病  力有关的基因是RPS23(ribosomal  protein  S23,核糖体蛋白S23)、 TLR  (Toll‑like receptor， Toll样受体)、 IL1(Interleukins  1， 白 细胞介素1)、 PPARG(Peroxisome  proliferator  activated  receptor  gamma， 过氧化物 酶 体增殖 激活受体γ)等基因。 [0004]白细胞介素18(Interleukin  18,IL18)是IL‑1家族中的一员， 最早发现  其具有诱 导干扰素 ‑γ的特性(Lee  JH,Cho DH,Park HJ.IL‑18and Cutaneous Inflammatory   Diseases.Int  J Mol Sci.2015Dec  9； 16(12):29 357‑69)。 而白细胞  介素是多数源于白细 胞并主要在白细胞间起免疫调节作用的蛋白， 因为白细  胞介素成员较多， 因此成为免疫 学 领域中庞大的、 重要的一类细胞因子(李  琦涵， 施海晶.免疫学概览(原著第二版)[M].北 京:现代生物技术与医药科技  出版中心,2005)。 在抗病毒、 免疫应答和免疫调节中发挥着 重要的作在调节  先天和后天免疫反应中起着关键作用。 但是IL18基因与免疫性状是否有 关， 有什么关系并不清楚。 因此本发明以IL18基因作为候选基因， 通过PCR扩  增、 DNA测序 和序列分析， 探讨其不同基因型与 绵羊免疫相关性状的关联性，  以期为提高绵羊的抗病性 提供一个新的分子标记。说　明　书 1/6 页 3 CN 115478111 A 3