(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210623175.2 (22)申请日 2022.06.02 (71)申请人 核工业四一六医院 地址 610000 四川省成 都市二环路北四段4 号 (72)发明人 公利鑫　李静怡　段文芳　何弢　 蒋胜　 (74)专利代理 机构 成都高远知识产权代理事务 所(普通合伙) 51222 专利代理师 肖柯岑　张娟 (51)Int.Cl. C12Q 1/6851(2018.01) C12Q 1/6876(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种TaqMan探针实时荧光定量PCR检测用组 合物 (57)摘要 本发明提供了一种逆转录引物、 下游引物和 TaqMan探针序列的组合物， 所述逆转录引物序列 包括TaqMan探针序列和PCR下游引物序列。 本发 明组合物具有通用性， 只需要根据目标基因设计 上游引物， 与本发明组合物一起使用即可用于不 同的基因检测， 简化了实验前期准备工作以及实 验操作过程， 大 大降低了实验成本 。 权利要求书1页 说明书4页 序列表2页 附图2页 CN 114891864 A 2022.08.12 CN 114891864 A 1.一种TaqMan探针实时荧光定量PCR检测用组合物， 其特征在于， 它由逆转录引物、 TaqMan探针、 PCR下游引物组成； 所述逆转录引物序列包括TaqMan探针序列和PCR下游引物序列。 2.如权利要求1所述的组合物， 其特 征在于， 所述逆转录引物的序列为： S1‑L‑S2‑ST； 其中， S1的序列与TaqMan探针序列相同， S2的序列与PCR扩增的下游引物的序列相同， L 为2～5nt的任意核苷酸序列， ST为10～15nt的Po ly(T)序列。 3.如权利要求2所述的组合物， 其特征在于， L为2nt的任 意核苷酸序列， ST为12nt的Pol y (T)序列， 优选地， 所述 L为AC。 4.如权利要求3所述的组合物， 其特征在于， 所述逆转录引 物具有如SEQ  ID NO.1所示 的核苷酸序列； 所述TaqMan探针具有如SEQ  ID NO.2所示的核苷酸序列； 所述PCR下游引物具有如SEQ  ID NO.3所示的核苷酸序列。 5.如权利要求1所述的组合物， 其特征在于， 所述逆转录引 物、 TaqMan探针、 PCR下游引 物的摩尔比为： (0.01～0.0 5):(1.5～3):1， 优选为0.02:2:1。 6.如权利要求1～5任一项所述的组合物， 其特征在于， 所述TaqMan探针序列的5 ’端连 接有荧光报告基团， 3 ’端连接有荧 光淬灭基团。 7.如权利要求6所述的组合物， 其特征在于， 所述荧光报告基团为FAM、 TET、 VIC或HEX基 团， 所述荧光淬灭基团为MGB、 BHQ或TAMRA基团； 优选地， 所述 荧光报告基团为FAM基团， 所述 荧光淬灭基团为MGB基团。 8.权利要求1～7任一项所述的组合物在TaqMan探针实时荧光定量PCR检测试剂盒中的 用途。 9.一种TaqMan探针实时荧光定量PCR检测试剂盒， 其特征在于， 它包含权利要求1～7任 一项所述的组合物。 10.如权利要求9所述的试剂盒， 其特征在于， 它是检测U6基因、 miR ‑16、 miR‑126或miR ‑ 208的试剂盒； 所述检测U6基因的试剂盒还 含有序列如SEQ  ID NO.4所示的上游引物； 所述检测miR ‑16的试剂盒还 含有序列如SEQ  ID NO.5所示的上游引物； 所述检测miR ‑126基因的试剂盒还 含有序列如SEQ  ID NO.6所示的上游引物； 所述检测miR ‑208基因的试剂盒还 含有序列如SEQ  ID NO.7所示的上游引物。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114891864 A 2一种TaqMa n探针实时荧光定量PCR检测用组合物 技术领域 [0001]本发明属于microRNA定量检测领域， 具体涉及一种TaqMan探针实时荧光定量PCR 检测用组合物。 背景技术 [0002]实时荧光定量PC R(简称qPCR)是指在PC R反应体系中加入荧光化学物质， 利用荧光 信号积累实时监测PCR扩增产物并进行定量分析的方法。 根据所用荧光化学物质的不同， qPCR可分为荧光染料法(SYBR  Green I法为代表)和荧光探针法(TaqMan探针法为代表)。 TaqMan探针法qPCR是使用TaqMan荧光探针进行荧光检测的方法。 其基本原理是PCR扩增时 在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针， 该探针两端分别标记一个报告荧光基 团和一个淬灭荧光基团。 开始时， 探针完整地结合在DNA任意一条单链上， 报告基团发射的 荧光信号被淬灭基团吸收， 检测不到荧光信号； PCR扩增时， Taq酶的5' ‑3'核酸外切酶活性 将探针酶切降解， 使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离， 从而发出荧光， 切割的荧光分子数 与PCR产物的数量 成正比， 因此， 通过检测PCR反应体系中的荧光 强度可以达到检测P CR产物 扩增量的目的。 TaqMan探针 法是目前microRNA定量研究的金标准， 具有高特异性、 高灵敏度 的优势。 [0003]用TaqMan探针法进行microRNA定量检测的完整流程包括先用逆转录引物对 microRNA进行逆转录产生cDNA， 再采用上下游引物对cDNA进行PCR扩增， 在扩增过程中将与 cDNA结合的TaqMan探针破坏， 释放出荧光基团实现检测。 目前常用的microRNA逆转录方法 主要有茎环法与加尾法两种方式， 两种逆转录产生的cDNA可使用TaqMan探针进行定量分 析， 但是目前市面上的检测试剂盒都是针对 单一的micr oRNA的进行检测的， 即逆转录引物、 上下游引物、 TaqMan探针的序列需针对所要检测的microRNA特异性定制。 [0004]对不同的microRNA检测， 需要定制不同的检测试剂盒(逆转录引物、 上下游引物、 TaqMan探针的序列)的方式， 使 得检测前期工作和流程增加， 检测成本也较高。 因此， 研发具 有通用性、 普适 性的检测序列组成， 具有重要的意 义。 发明内容 [0005]本发明的目的在于提供一种可以实现通用的TaqMan探针实时荧光定量PC R检测用 逆转录引物、 TaqMan探针和PCR下游引物。 [0006]本发明提供了一种TaqMan探针 实时荧光定量PC R检测用组合物， 它由逆转录引物、 TaqMan探针、 PCR下游引物组成； [0007]所述逆转录引物序列包括TaqMan探针序列和PCR下游引物序列。 [0008]进一步地， 上述逆转录引物的序列为： S1‑L‑S2‑ST； [0009]其中， S1的序列与T aqMan探针序列相同， S2的序列与PCR扩增的下游引物的序列相 同， L为2～5nt的任意核苷酸序列， ST为10～15nt的Po ly(T)序列。 [0010]更进一步地， 上述L为2nt的任意核苷酸序列， ST为12nt的Poly(T)序列， 优选地， 所说　明　书 1/4 页 3 CN 114891864 A 3