(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211388142.0 (22)申请日 2022.11.08 (71)申请人 南通和福生物科技有限公司 地址 226299 江苏省南 通市启东市生命健 康科技园金 科路955号7幢1楼 (72)发明人 刘小芳　李文书　 (51)Int.Cl. C12Q 1/6858(2018.01) C12Q 1/6883(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种SNP检测方法及试剂盒 (57)摘要 本发明公开了一种SNP检测方法及试剂盒， 配方包括： Tris、 （NH4）2SO4、 KCl、 MgCl2、 dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP、 MTHFR  677R1、 MT HFR 677T‑F1、 MTHFR C677‑F1、 MTHFR  677T‑MGB、 MTHFR  C677‑ MGB、 Taq酶、 DNA模板以及水， SNP检测方法， 包括 以下步骤： 步骤一， 设计引物； 步骤二， 引入突变； 步骤三， 设计探针； 步骤四， 提取； 步骤五， 处理； 步骤六， 反应； 其中上述步骤一中， 在SNP位置设 计ARMS‑qPCR引物； 其中上述步骤二中， 为了减少 引物的非特异扩增， 两条等位基因引物在SNP位 点前后1‑2个碱基处， 人为各引入一个突变； 引入 的突变所处的位置是不同的； 其中上述步骤三 中， 设计等位基因特异性的MGB探针； 该发明， 开 发了一种新的ARMS ‑qPCR的引物探针设计方法， 解决了ARMS ‑PCR不能在一管中检测等位基因的 缺陷。 权利要求书1页 说明书4页 附图3页 CN 115521974 A 2022.12.27 CN 115521974 A 1.一种SNP检测试剂盒， 配方包括： Tris、 （NH4）2SO4、 KCl、 MgCl2、 dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP、 MTHFR 677R1、 MTHFR  677T‑F1、 MTHFR  C677‑F1、 MTHFR  677T‑MGB、 MTHFR  C677‑MGB、 Taq酶、 DNA模板以及水， 其特征在于： 各组分的用量或终浓度分别是： 10～50mM的Tris、 125～375mM 的 （NH4）2SO4、 0～50mM的KCl、 1.5～5mM的MgCl2、 0.05～0.4uM的dATP、 0.05～0.4uM的dCTP、 0.05～0.4uM的dGTP、 0.05  ～0.4uM的dTTP、 0.05～1pM的MTHFR  677R1、 0.05～0.5pM的 MTHFR 677T‑F1、 0.05～0.5pM的MTHFR  C677‑F1、 0.05～0.5pM的MTHFR  677T‑MGB、 0.05～ 0.5pM的MTHFR  C677‑MGB、 0.05～0.2U/ μl的Taq酶、 1～5 0ng/反应DNA模板以及适 量的水。 2.根据权利要求1所述的一种SNP检测试剂盒， 其特征在于： 所述Tris、 （NH4）2SO4、 KCl、 MgCl2、 dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP、 MTHFR  677R1、 MTHFR  677T‑F1、 MTHFR  C677‑F1、 MTHFR  677T‑ MGB、 MTHFR  C677‑MGB、 Taq酶、 DNA模板以及水的总体积之和为3 0 μL。 3.根据权利要求1所述的一种SNP检测试剂盒， 其特 征在于： 所述Tris的pH为8.3 。 4.根据权利要求1所述的一种SNP检测试剂盒， 其特征在于： 所述水为经过处理的纯化 水。 5.一种SNP检测方法， 包括以下步骤： 步骤一， 设计引物； 步骤二， 引 入突变； 步骤三， 设 计探针； 步骤四， 提取； 步骤五， 处 理； 步骤六， 反应； 其特 征在于： 其中上述 步骤一中， 在SNP位置设计ARMS ‑qPCR引物； 其中上述步骤二中， 为了减少引物的非特异扩增， 两条等位基因引物在SNP位点前后1 ‑ 2个碱基处， 人为各引入一个突变； 其中上述 步骤三中， 设计等 位基因特异性的MGB探针； 其中上述步骤四中， 采用外周血DNA提取试剂盒提取EDTA或枸橼酸钠抗凝的基因组 DNA； 其中上述步骤五中， 采用荧光PCR仪、 高速离心机、 低速离心机、 恒温干浴器、 漩涡震荡 仪、 冰箱以及其 他设备对SNP进行处 理； 其中上述步骤六中， 使用SNP检测试剂盒对步骤五中处理后的SNP进行检测， 在检测反 应的过程中， 第一步为在95℃的环境温度下进行10分钟的一个循环； 第二步为在95℃的环 境温度下处理10秒， 然后在60℃的环 境温度下处理35秒， 然后进行45个循环， 设置在60℃下 进行检测FAM、 HEX的荧光收集； 第三步为在25℃的环 境温度下处理10秒； 随后即可对反应结 果进行分析。 6.根据权利要求5所述的一种SNP检测方法， 其特征在于： 所述步骤二中， 引入的突变所 处的位置是不同的。 7.根据权利要求5所述的一种SNP检测方法， 其特征在于： 所述步骤三中， 等位基因存在 3个碱基差异， 因此MGB探针不 容易非特异杂交显色。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115521974 A 2一种SNP检测方 法及试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及生物检测技 术领域， 具体为 一种SNP检测方法及试剂盒。 背景技术 [0002]SNP是在同一群体中， 某个基因座上存在两个或两个以上的等位基因， 有时这种等 位基因差异会导致个体存在较大的表型差异， 在疾病诊断、 药物代谢、 疾病成因上具有很高 的临床价值。 传统的SNP检测方法一般用ARMS ‑PCR方法， 但是由于ARMS ‑PCR中用于区分突变 是设计在其中一条引物上， 在荧光PCR系统中， 只能通过两个反应孔来比较Ct值进行区分； 因此， 设计一种SNP检测方法及试剂盒是很有必要的。 发明内容 [0003]本发明的目的在于提供一种SNP检测方法及试剂盒， 以解决上述背景技术中提出 的问题。 [0004]为实现上述目的， 本发明提供如下技术方案： 一种SNP检测试剂盒， 配方包括： Tris、 (NH4)2SO4、 KCl、 MgCl2、 dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP、 MTHFR  677R1、 MTHFR  677T‑F1、 MTHFR   C677‑F1、 MTHFR  677T‑MGB、 MTHFR  C677‑MGB、 Taq酶、 DNA模板以及水， 各组分的用量或终浓 度分别是： 10～50mM的Tris、 125～375mM的(NH4)2SO4、 0～50mM的KCl、 1.5～5mM的MgCl2、 0.05～0.4uM的dATP、 0.05～0.4uM的dCTP、 0.05～0.4uM的dGTP、 0.05～0.4uM的dTTP、 0.05 ～1pM的MTH FR 677R1、 0.05～0.5pM的MTHF R 677T‑F1、 0.05～0.5pM的MTHF R C677‑F1、 0.05 ～0.5pM的MTHFR  677T‑MGB、 0.05～0.5pM的MTHFR  C677‑MGB、 0.05～0.2U/ μl的Taq酶、 1～ 50ng/反应DNA模板以及适 量的水。 [0005]优选的， 所述Tris、 (NH4)2SO4、 KCl、 MgCl2、 dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP、 MTHFR  677R1、 MTHFR 677T‑F1、 MTHFR  C677‑F1、 MTHFR 677T‑MGB、 MTHF R C677‑MGB、 Taq酶、 DNA模板以及水 的总体积之和为3 0 μL。 [0006]优选的， 所述Tris的pH为8.3 。 [0007]优选的， 所述水为经 过处理的纯化水。 [0008]一种SNP检测 方法， 包括以下步骤： 步骤一， 设计引物； 步骤二， 引入突变； 步骤三， 设计探针； 步骤四， 提取； 步骤五， 处 理； 步骤六， 反应； [0009]其中上述 步骤一中， 在SNP位置设计ARMS ‑qPCR引物； [0010]其中上述步骤二中， 为了减少引物的非特异扩增， 两条等位基因引物在S NP位点前 后1‑2个碱基处， 人为各引入一个突变； [0011]其中上述 步骤三中， 设计等 位基因特异性的MGB探针； [0012]其中上述步骤四中， 采用外周血DNA提取试剂盒提取EDTA或枸橼酸钠抗凝的基因 组DNA； [0013]其中上述步骤五中， 采用荧光PCR仪、 高速离心机、 低速离心机、 恒温干浴器、 漩涡 震荡仪、 冰箱以及其 他设备对SNP进行处 理；说　明　书 1/4 页 3 CN 115521974 A 3