(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210751362.9 (22)申请日 2022.06.29 (71)申请人 郑州大学第二附属医院 地址 450014 河南省郑州市金 水区经八 路2 号 (72)发明人 张岩　冯煜舒　高亚岚　 (74)专利代理 机构 郑州市华翔专利代理事务所 (普通合伙) 41122 专利代理师 张爱军 (51)Int.Cl. C12N 15/62(2006.01) C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种FYCO1-ALK融合基因及其检测试剂盒和 应用 (57)摘要 本发明涉及一种非小细胞肺癌FYCO1 ‑ALK融 合基因及其检测试剂盒和应用， ALK基因的融合 伴侣基因为FYCO1基因， 基因融合突变发生于 FYCO1基因的12号外显子与ALK基因的20号外显 子之间； FYCO1 ‑ALK融合基因的序列如SEQ  ID  NO.1所示。 其中， FYCO1基因位于3号染色体 3p21.31上， 位置45917903 ‑45995824， 共23个外 显子。 ALK基因位于2号染色体2p23.2 ‑p23.1上， 位置2919 0992‑29921589， 共29个外显子。 本发明 通过高通量测序技术发现ALK基因新融合伴侣， 设计特异性的FYCO1 ‑ALK融合基因以及内参 HPRT1基因的上下游引物、 Taqman探针， 具有准确 度高、 特异性 好、 操作简便、 检测快速等优点。 权利要求书2页 说明书7页 序列表2页 附图4页 CN 114990142 A 2022.09.02 CN 114990142 A 1.一种FYCO1 ‑ALK融合基因， 其特征在于， ALK基因的融合伴侣基因为FYCO1基因， 基因 融合突变发生于FYCO1基因的12号外显子与ALK基因的20号外显子之间； FYCO1 ‑ALK融合基 因的序列如SEQ  ID NO.1所示。 2.如权利要求1所述的FYCO1 ‑ALK融合基因， 其特征在于， 所述FYCO1基因位于3号染色 体3p21.31上， 位置4591790 3‑45995824， 共23个外 显子。 3.如权利要求1所述的FYCO1 ‑ALK融合基因， 其特征在于， 所述ALK基因位于2号染色体 2p23.2‑p23.1上， 位置2 9190992‑29921589， 共2 9个外显子。 4.一种检测权利要求1所述FYCO1 ‑ALK融合基因的组合物， 其特征在于， 包括FYCO1 ‑ALK 融合基因、 内参HPRT1基因的上游引物、 下游引物和探针序列， 具体如下： 上游引物FY CO1‑E12‑F： AAGCGGGAGTTCAGCTGGATGG； (SEQ ID NO.2)； 下游引物 ALK‑E20‑R ： CTCCATCTGCATG GCTTGCAGC (SEQ ID NO.3)； 探针FYCO1‑ALK‑Probe： FAM ‑5‑CCGGAAGCACCAGGA‑3‑MGB(SEQ ID NO.4)； 上游引物HPRT1 ‑F： 5‑CAGGCAGTATA ATCCAAAGATGGTCA‑3(SEQ ID NO.5)； 下游引物HPRT1 ‑R： 5‑GTCTGGCTTATATCCAACACTTCGT‑3(SEQ ID NO.6)； 探针HPRT1 ‑  Probe： VIC ‑5‑TCACCAGCAAGCTT‑3‑MGB(SEQ ID NO.7)。 5.一种检测权利要求 4所述FYCO1‑ALK融合基因的试剂盒， 其特 征在于， 包括如下成份： PCR反应液 ①： 权利要求 4所述组合物、 镁离 子、 dNTP、 去离 子水； PCR反应液 ②： PCR buffer； PCR混合酶： Tap酶、 逆转录酶、 UDG酶； 阳性对照： FY CO1‑ALK融合基因的质粒、 HPRT1基因的质粒； 阴性对照： 去离 子水。 6.一种以非诊断和治疗目的检测FYCO1 ‑ALK融合基因的方法， 其特征在于， 包括以下步 骤： （1） 提取待测样本RNA； （2） 使用权利要求5所述试剂盒， 进行荧 光定量PCR反应； （3） 根据PCR扩增结果， 判断检测结果。 7.如权利 要求6所述的方法， 其特征在于， 所述荧光定量PCR的反应体系为：  PCR反应液 ①： 各引物和探针的浓度均为10  pmol， 上游引物共1.0 μL、 下游引物共1.0 μL、 探针共0.7 μL， 25mM镁离 子0.5 μL， 25mM  dNTP0.3 μL， 去离 子水30.5 μL， 共34 μL； PCR反应液 ②： 5X PCR buffer 10 μL； PCR混合酶： 5U/ μL  Tap酶0.5 μL、 5U/ μL逆转录酶0.2 μL、 5U/ μL  UDG酶0.3 μL， 共1 μL； 阳性对照： 10ng/ μL  FYCO1‑ALK融合基因的质粒、 10ng/ μL  HPRT1基因的质粒， 共5 μL； 阴性对照： 去离 子水5 μL。 8.如权利要求6所述的方法， 其特征在于， 所述荧光定量PCR的扩增程序为： 第一阶段： 42℃、 5min， 9 5℃、 5min； 第二阶段： 9 5℃、 25s， 64℃、 2 0s， 72℃、 2 0 s， 10个循环； 第三阶段： 9 3 ℃、 25 s， 60℃、 35  s， 72℃、 20  s， 36个循环； 信号收集： 第 三阶段60℃时收集FAM和 VIC荧光 信号。 9.如权利要求6所述的方法， 其特 征在于， 所述检测结果的判断方法为： 阳性对照的FAM和VIC荧光信号有扩增曲线升起， 且Ct值均<26， 阴性对照的FAM和VIC荧权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114990142 A 2光信号无扩增曲线升起； 若阳性对照 或阴性对照结果有异常， 则需检测实验仪器及实验条 件， 解决问题后重新检测； 若待测样本 的VIC荧光信号有扩增曲线升起， 且Ct值≤27； FAM荧光信号有扩增曲线升 起， 且Ct值≤27， 则待测样本有FY CO1‑ALK融合基因的突变； 若待测样本的FAM荧光信号的Ct值＞27， 则待测样本不含有FYCO1 ‑ALK融合基因或者低 于检测下限； 若待测样本的VIC荧 光信号的Ct值＞27， 则重新 提取RNA后再检测。 10.如权利要求1所述的FY CO1‑ALK融合基因在治疗非小细胞肺癌中的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114990142 A 3