(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210684411.1 (22)申请日 2022.06.16 (71)申请人 温州医科 大学 地址 325000 浙江省温州市瓯海区东方南 路38号温州市国家大 学科技园孵化器 (72)发明人 杨政权　丁春明　宋梦慧　金胜男　 (74)专利代理 机构 杭州中成专利事务所有限公 司 33212 专利代理师 金祺 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种DNA甲基化检测方法及所用试剂 (57)摘要 本发明涉及生物医学领域， 特别是涉及一种 DNA甲基化检测方法及所用试剂。 本发明公开了 一种用于检测甲基化标志物的试剂， 甲基化标志 物为SDC2 ‑1、 SDC2‑2、 SDC2‑4、 NDRG4‑1、 NDRG4‑2、 NDRG4‑3、 NDRG4‑4、 NDRG4‑5、 NDRG4‑7中的至少任 一。 本发明还同时公开了上述甲基化标志物的引 物和探针。 本发 明用于诊断受试者中是否存在结 直肠良性息肉、 进展性腺瘤或结直肠癌； 检测受 试者的组织或粪便样本中的DNA中的甲基化标志 物以判断DNA的甲基化水平， 如果甲基化水平高 于正常对照样本的DNA甲基化水平， 则确定受试 者中存在结直肠良性息肉、 进展性腺瘤或结直肠 癌。 权利要求书1页 说明书20页 序列表5页 附图9页 CN 115161400 A 2022.10.11 CN 115161400 A 1.用于检测甲基化标志物的试剂， 其特征在于： 所述甲基化标志物为SDC2 ‑1、 SDC2‑2、 SDC2‑4、 NDRG4‑1、 NDRG4‑2、 NDRG4‑3、 NDRG4‑4、 NDRG4‑5、 NDRG4‑7中的至少任一。 2.根据权利要求1所述的试剂， 其特征在于： 所述甲基化标志物为SDC2 ‑1、 SDC2‑2、 SDC2‑4、 NDRG4‑1、 NDRG4‑2、 NDRG4‑3、 NDRG4‑4、 NDRG4‑5和NDRG4 ‑7的组合。 3.根据权利要求1或2所述的试剂， 其特 征在于： 甲基化标志 物的引物和探针为： SDC2_1_F CAACAAGTGAGAG GGTGCTGT SDC2_1_R GGGCTCAGGGGCACTCA SDC2_1_P CAGCTGTG GGTGGTGGGAGCAG SDC2_2_F GGGCTTGGGGGTGCTT SDC2_2_R ACCAACAAGTGAGAG GGCA SDC2_2_P CCAGGGCACAGCTGCAG GC SDC2_4_F CCTCCTGCCCAGTGCTT SDC2_4_R CCAAGCCTGAGCCACAATCA SDC2_4_P CAGATTCATGTGCACAG GCTGCAC NDRG4_1_F  GTGCACCCAGCACAGTCTGT NDRG4_1_R  GGACACCCCAGTCAATCCACA NDRG4_1_P  CCACCAACTTCTCACCCACTCCACC NDRG4_2_F  GGTGAGTGGGGACTGTGATGT NDRG4_2_R  CAGAGCAG GTGAGAAGTCAGCA NDRG4_2_P  CTGGGGGACACCCTGGTTGATCTG NDRG4_3_F  ACTGGGCACCCCAGCTGT NDRG4_3_R  GCTAGTCCCAGACAGAC CACA NDRG4_3_P  AGAAGGTGGAAGCCATGTGTGAG G NDRG4_4_F  GGCTAGTCCTGGATGGACTGT NDRG4_4_R  CAGGCACCCCAGCCACA NDRG4_4_P  CCCTTGTGTGTG GCTTCTGCCTTCT NDRG4_5_F  TGCCAAACCCATGTGGGCAT NDRG4_5_R  CTGCAGGGGCAGAGGCCA NDRG4_5_P  CTGTGGTGCACTGC CCCCAG NDRG4_7_F  TTGGTGGTGCTGAAGCCCT NDRG4_7_R  GCTCAGGGGCAAGGGCA NDRG4_7_P  CCTGCCTGTGTGTCTGTCT TGTCT。 4.根据权利要求3所述的试剂， 其特 征在于试剂盒包括： KAPA PROBE FAST qPCR Master Mix、 权利要求3所述的引物和探针、 内参基因引物混 合物、 内参基因探针、 去酶水、 Rox。 5.根据权利要求1～4任一所述的试剂的用途， 其特征在于： 诊断受试者中是否存在结 直肠良性息肉、 进 展性腺瘤或结直肠癌。 6.一种DNA甲基化检测方法， 其特征在于： 使用Tet酶将mC氧化为fC和caC， 经过吡啶硼 烷还原为DHU， 而保存未甲基化的C保持不变。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115161400 A 2一种DNA甲 基化检测方 法及所用试剂 技术领域 [0001]本发明涉及生物医学 领域， 特别是 涉及一种DNA甲基化检测方法及所用试剂。 背景技术 [0002]表观遗传学改变在癌症的发生发展中起着重要的作用。 表观遗传学指在DNA序列 不发生改变的情况  下引起基因表达或功能变化， 主要包括DNA甲基化、 组蛋白修饰等[1]。 DNA甲基化是最主要的表观遗传  学修饰之一， 参与细胞分化和发育、 肿瘤发生和其他疾病。 在正常哺乳动 物细胞中， 胞嘧啶甲基化(5 ‑mC) 几乎仅存在于CpG二核苷酸中。 一般情 况下， 70％‑90％的散在CpG位点是甲基化的， 而未甲基化的CpG  通常只存在于被称为CpG岛的DNA 区域。 CpG岛是基因组中CpG二核苷酸的百分比高于随机分布的CpG  二核苷酸的预期区域， 其所在位置多为基因启动子区域， 与人类基因组编 码基因相关， 正常状态下通常处  于低甲 基化状态[2]。 然而， 对癌症表观基因组的全基因组研 究表明， 肿瘤细胞基因组中部分CpG岛 存在异 常甲基化， 表明CpG岛甲基化可能参与肿瘤的发生发展 过程[3]。 基因启动子区域CpG 岛的高甲基化可以  抑制下游基因的表达， 促进肿瘤发生。 研究表明， 异常DNA甲基化在癌症 中广泛存在， 可能是肿瘤发生  过程中最早发生的变化之一[4]。 与体细胞突变 分析相比， DNA 甲基化分析在癌症检测方面具有以下优势：  (1)异常甲基化在癌症 早期就出现； (2)甲基化 发生频率较基因突变更为频繁； (3)DNA甲基化多为  连续位点 发生， 有多个可检测的甲基化 靶区， 以及每 个目标基因 组区域内多个改变的CpG位 点[5]。 [0003]DNA甲基化的检测方法有多种， 亚硫酸氢盐处理转化法一直是D NA甲基化分析的标 准方法。 该方法  于1992年由MARIANNE  FROMMER首次提出[6]， 其原理是在酸性和高温条件 下， 亚硫酸氢盐将未甲基  化的胞嘧啶(C)脱氨 转化成尿嘧啶(U)， 通过PCR扩增将 尿嘧啶(U) 解读为胸腺嘧啶(T)， 而甲基化  的胞嘧啶(mC)保持不变， 随后用测序、 定量PCR和芯片技术 分析比较转化和未转化的DNA序列， 来判  断DNA甲基化水平。 基于亚硫酸氢盐的转化技术已 经成为许多技术的基础， 如WGBS、 RRBS、 MCTAseq、  靶向亚硫酸氢盐测序、 甲基化 阵列、 MSP 等[7]。 [0004]然而， 亚硫酸氢盐转化法有两大主要缺点： 第一， 亚硫酸氢盐处理是一种苛刻的化 学反应， 在酸性和  高温条件下， 由于脱嘧啶作用， 大部分DNA会被降解， 导致该技术需要较 多的起始量DNA， 因此在微量  DNA样本中应用严重受限。 第二， 未修饰的胞嘧啶约占人类基 因组中总胞嘧啶的95％， 亚硫酸氢盐转化  将未甲基化的胞嘧啶全部转化为尿嘧啶， 经PCR 扩增被识别为胸腺嘧啶， 导致基因组由原本ATCG四种  碱基平衡组成降低为仅剩余ATG碱基 为主， 严重降低了DNA序列复杂度， 导致引物探针 设计困难、 扩增  偏倚大、 测序质量差、 基因 组覆盖不均和 测序成本增 加。 且由于DNA序列复杂度降低， 多重PCR扩增设  计尤其困难。 [0005]使用甲基化敏感的限制性内切酶切割特定核苷酸序列也是DNA甲基化研究的经典 方法。 这里使用的  甲基化敏感限制性内切酶(如HpaII、 BstUI、 AciI和Hin6I)切割未甲基化 区域， 当目标序列中的胞嘧啶  残基被甲基化时， 这些酶将不能切断识别序列。 Gabriel   Beikircher等人将该技术和qPCR技术相结合， 开  发了甲基化敏感 的限制性内切酶(MSRE)说　明　书 1/20 页 3 CN 115161400 A 3