(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211113938.5 (22)申请日 2022.09.14 (71)申请人 昆山迪安医学检验实验室有限公司 地址 215300 江苏省苏州市昆山市花 桥镇 金洋路15号金融园15号楼 (72)发明人 周明先　马楠　田明民　左志琴　 (74)专利代理 机构 北京远智汇知识产权代理有 限公司 1 1659 专利代理师 刘彦伟 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种16型、 18型HPV病毒核酸荧光定量PCR检 测方法及其试剂盒 (57)摘要 本发明涉及生物技术领域， 公开了一种16 型、 18型HPV病毒核 酸荧光定量PCR检测方法及其 试剂盒， 该检测方法如下： 核 酸的提取； 荧光定量 RT‑PCR的检测。 本发明提供的一种16 型、 18型HPV 病毒核酸荧光定量PCR检测方法反应快速， 一般 1.5到2小时即可得到反应结果， 并且成本低、 无 假阳性， 适合于大规模临床开展， 从而实现对HPV 病毒的快速、 有效且准确的定性检测， 因而能保 证及时的病例诊 治及治疗效果监测。 权利要求书2页 说明书5页 附图2页 CN 115261521 A 2022.11.01 CN 115261521 A 1.一种16型、 18型HPV病毒核酸荧光定量PCR检测方法， 其特征在于， 所述检测方法的步 骤如下： 步骤1： 提取待测样品总 DNA： 取1mL样本至1.5mL离心管 中， 12000 ‑13000rpm离心2 ‑10分 钟， 弃上清； 沉淀中加入500 μL灭菌生理盐水混匀， 12000 ‑13000rpm离心2 ‑10分钟； 再用灭菌 生理盐水重复洗涤一次； 去尽上清， 沉淀中加入50 μL  HPV裂解液充分混匀， 95 ‑100℃作用8 ‑ 10分钟， 120 00‑13000rpm离心 2‑10分钟， 上清即为纯化的病毒 核酸， 作为待检模板； 所述裂解液包括Tris.H CL、 Trito n‑X‑100、 cheLex‑100； 步骤2： 制备2份反应液， 每 份反应液包括预混合液、 一对引物及相应的探针； 所述引物包括正向引物和逆向引物， 所述16型HPV正向引物的核苷酸序列如SEQ  ID  NO:1所示， 所述18型HPV正向引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO:3所示； 与所述各正向引物相 对应的所述逆向引物的核苷酸序列依次如SEQ  ID NO:2， SEQ  ID NO:4所示； 与所述各正向 引物相对应的所述探针的核苷酸序列依次分别如SEQ  ID NO:5， SEQ ID NO:6所示； 步骤3： 将两种对应的模板进行浓度稀释， 制 成标准曲线样品， 与所述各正向引物相对 应的2种模板的核苷酸序列依次分别如SEQ  ID NO:7～8所示； 步骤4： 试剂的阴性对照、 待测样品的阴性对照以及加入了标准品的待测样品上样； 步骤5： QPCR反应； 步骤6： 将2种模板分别梯度稀释制成标准曲线样品， 分析待测样品的检测结果。 2.根据权利要求1所述一种16型、 18型HPV病毒核酸荧光定量PCR检测方法， 其特征在 于： 标准样品的浓度梯度为每5 μL含有1 ×105， 1×104， 1×103， 1×102及10个靶序列拷贝。 3.根据权利要求1所述一种16型、 18型HPV病毒核酸荧光定量PCR检测方法， 其特征在 于： 采用ABI  7500荧光定量PCR仪， 荧光信号收集时设定为FAM和VIC(HEX)荧光素， 荧光信号 收集设在6 0℃。 4.一种用于权利 要求1至3任一项所述一种16型、 18型HPV病毒核酸荧光定量PCR检测方 法的PCR检测试剂盒， 其特征在于： 包括两组对应的引物及相应的探针以及反应液， 还包括 阳性质控品和阴性质控品； 所述阴性质控品为灭菌生理盐水； 所述阳性质控品和弱阳性质控品是以提纯的16型、 18型HPV病毒基因组为模板， 由2种 型别相应的基因扩增引物进行PCR扩增， 2种扩增产物连接， 经基因测序确认正确后包装所 得的假病毒； 探针序列的5 ’端标记有荧光报告基团， 3 ’端标记有荧光淬灭基团， 各型别检测引物及 探针序列如下： HPV16型： 上游引物HPV16 ‑F： 核苷酸序列如SEQ  ID NO:1： CAC AGT TAT GCA CAG AGC TGC； 下游引物HPV16 ‑R： 核苷酸序列如SEQ  ID NO:2： CAT  ATA TTC ATG CAA TGT AGG TGT  A； Taqman荧光探针HPV16 ‑P： 核苷酸序列如SEQ  ID NO:5： TGGCAGCACATAATGACATATTTGTA CTGCGT； HPV18型： 上游引物HPV18 ‑F： 核苷酸序列如SEQ  ID NO:10： CAC  TTC ACT GCA AGA CAT AGA；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115261521 A 2下游引物HPV18 ‑R： 核苷酸序列如SEQ  ID NO:11： GTT GTG AAA TCG TCG TTT TTC A； T a q m a n 荧 光 探 针 H P V 1 8 ‑P ：核 苷 酸 序 列 如 S E Q  I D N O : 6 ： AGGGATCCTTATTTTCAGCCGGTGCAG。 5.根据权利要求4所述的PCR检测试剂盒， 其特征在于： 所述荧光报告基团选自6 ‑羧基 荧光素、 六氯 ‑6‑甲基荧光素、 VIC荧光染料、 四氯 ‑6‑羧基荧光素、 羧基 ‑X‑罗丹明、 6 ‑羧基四 甲基罗丹明、 磺酰罗丹明、 6 ‑羧基‑4’,5’ ‑二氯‑2’,7’ ‑二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、 花菁 3、 花菁3.5、 花菁5和花菁5.5中的至少一种； 所述荧光淬灭基团选自6 ‑羧基四甲基罗丹明、 4‑(4‑二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、 黑洞淬灭剂1、 黑洞淬灭剂2或黑洞淬灭剂3中的至少一 种。 6.根据权利要求4所述的PCR检测试剂盒， 其特征在于： 所述阳性质控品中假病毒的浓 度为1×105拷贝/mL， 所述弱阳性质控品中假病毒的浓度为1 ×103拷贝/mL。 7.根据权利要求4所述的PCR检测试剂 盒， 其特征在于： 各组引物探针混合液中， 上游引 物、 下游引物和探针的浓度均为10 ‑15 μM， 上游引物用量0.75 μL， 下游引物用量0.75 μL， 探针 用量0.5‑1 μL， 最后用无菌超纯 水补足至 5.5 μL。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115261521 A 3